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小鹅瘟(Gosling plague,GP)又名鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起雏鹅、雏番鸭以急性肠炎及肝、肾、心实质器官炎症为特征的烈性传染病。GPV的致病性强,致死率高,对养鹅业的影响严重,造成巨大的经济损失。由于本病长期困扰着养鹅业,因此制备单克隆抗体,并对相应抗原表位进行定位对本病的诊断和防治有重要意义。GPV VP3蛋白是鹅细小病毒的主要结构蛋白,也是病毒的主要衣壳蛋白,暴露于病毒粒子表面,含有GPV主要抗原决定簇,是GPV主要免疫保护性抗原,约占总蛋白的80%。因其能刺激机体产生具有中和作用的抗体,是研制基因工程重组疫苗的首选蛋白。通过免疫VP3蛋白制备抗GPV VP3的单克隆抗体,并利用单克隆抗体对GPV VP3的B细胞抗原表位进行定位,有助于了解其抗原结构与功能的关系,在小鹅瘟病的胶体金、ELISA等临床和实验室检测方法的建立,疫苗研制,疾病治疗等方面起到重要作用。本实验利用Ni-NTA亲和层析纯化后的GPV VP3重组蛋白作为免疫原,经腹腔接种免疫4~6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫3d后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,利用已建立的间接ELISA方法进行筛选,经有限稀释法进行4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPV VP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11、4A2。亚类鉴定1F1为IgG2b亚类,其余3株为IgG1亚类,轻链均为κ链。ELISA检测,其腹水效价分别达到1:819 200、1:1 638 400、1:409 600、1:819 200。Western blot鉴定表明获得的4株单抗均能特异性识别GPV VP3重组蛋白和GPV VP3天然蛋白;免疫电镜和间接免疫荧光证明4株单抗能够与GPV全病毒结合。根据实验室已鉴定的GPV VP3蛋白线性抗原表位区结果,设计并合成互相重叠5个氨基酸的10aa短肽寡聚核酸片段,退火后,连入pET-32a载体,诱导表达获得相应的小片段融合蛋白,利用制备的单抗通过Western blot进行抗原性鉴定。同样方法进行短肽片段两端氨基酸的逐个缺失,进一步定位出两个抗原表位为430~435aa和643~647aa。本研究制备了抗GPV VP3单克隆抗体,并对相应B细胞抗原表位进行了定位。为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法提供了物质基础,对设计新型GPV亚单位疫苗等方面具有重要意义,单抗和抗原表位均为GPV后续实验奠定物质基础,为其联合应用提供广泛的应用前景。