IgA肾病(IgA Nephropathy)是以肾小球系膜区IgA沉积为主要病理特征的一组原发性肾小球疾病，也是最常见的原发性肾小球肾炎和导致终末期肾病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的主要病因之一。IgA肾病的发病机制至今尚未明了，从目前研究来看，遗传因素、环境因素、免疫异常以及炎症介质失衡都与IgA肾病的发生、发展密切相关，其中遗传因素很可能在本病的发生、发展中发挥了关键作用。有证据显示，IgA肾病是一种多基因遗传病(polygenic inheritancedisorders)，其发生、发展与多种基因变异有关，目前这些证据主要来自流行病学调查、家族性IgA肾病的发现、IgA肾病的家族聚集现象、动物模型的建立和相关基因或致病基因的发现等。 Megsin是一种肾脏系膜细胞优势表达基因，在IgA肾病、糖尿病肾病等以系膜细胞增生、系膜基质积聚为主要病理改变的肾脏疾病中，其基因与蛋白表达水平均显著上调，Megsin转基因小鼠出现与人类．IgA肾病相似的肾脏病理改变。我们课题组的前期研究也发现，Megsin基因3端非翻译区C2093T和C2180T多态性与中国汉族人群IgA肾病的发生显著相关。但这一相关分析的研究结果并不表明2093和2180就是Megsin基因真正的致病位点，这两个位点也可能只是与真正的致病位点处于连锁不平衡状态，真正致病位点的确定还要依赖对Megsin基因各相关位点的进一步筛选和分析。 Megsin基因的发现虽然已有几年，但对其生物学功能及在肾脏疾病发生、发展中的作用还知之甚少，我们课题组虽发现Megsin基因C2093T和C2180T多态性与中国汉族人群IgA肾病的发生有关，但对该变异与汉族人群IgA肾病的临床表现及预后的关系并不清楚，对Megsin基因的生物学功能以及它如何促进肾脏疾病的发生、发展也很不了解，这也是我们想在下面的实验中进一步探讨的问题。 我们将继续应用以家庭为基础(Falnily-based Studies)的关联分析方法——单倍型相对危险度(haplotype relative risk，HRR)分析和传递／不平衡分析(transmission／Disequilibrium Test，TDT)，对Megsin基因与IgA肾病发生、发展有关的多态性位点进行筛选，希望能尽早发现真正的致病位点。同时通过基因转染、体外系膜细胞培养等方法，了解Megsin基因过度表达对体外系膜细胞增生和细胞外基质积聚的影响和机制。 实验一、中国汉族人群Megsin基因变异与lgA肾病的相关关系 1．中国汉族人群Megsin基因变异与部分多态性位点的鉴定和初步筛选 [目的]通过比较基因库中高加索人群的遗传资料，了解中国汉族人群Megsin基因变异，初步筛选适合做进一步相关分析的多态性位点。[方法]根据基因库中的遗传资料，挑选Megsin基因不同功能域的单核苷酸多态性(SNP)位点，应用聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和直接测序的方法，鉴定IgA肾病患者和正常对照者各位点基因型，计算各位点杂合度，根据杂合度大小和疾病组与正常对照组杂合度的差异，筛选适合做进一步相关分析的多态性位点。[结果]在12个从基因库中挑选的SNP位点中，有6个在我国汉族人群未发现具有多态性，另外6个证实有多态性，在第5内含子发现两个新的SNP位点。在8个多态性位点中，1个属少见多态，5个属常见多态，各SNP位点的杂合度在IgA肾病组和正常对照组差异无显著性(P>0.05)。[结论]中国汉族人群的Megsin基因与基因库中高加索人群相比存在较大差异，可能与中国汉族人群对IgA肾病的高易感性具有重要联系。 2．Megsin基因与中国汉族人群IgA。肾病的发生相关多态性位点筛选 [目的]筛选Megsin基因与中国汉族人群IgA肾病的发生相关多态性位点，为致病位点的确定积累依据。[方法]收集中国汉族人群IgA。肾病家系的血液或唾液标本并提取基因组DNA，应用PCR-RFLP或直接测序的方法鉴定各筛选位点基因型，通过TDT和HRR分析了解各目标位点与IgA肾病发生的关系。[结果]TDT和HRR分析显示，Megsin基因23167位点G等位基因从杂合子父母过度传递给患病子女，Megsin C25663G、23179 9T/10T、T23381C和C23415T位点各等位基因的传递无显著倾向性。[结论]Megsin基因A23167G多态性与中国汉族人群IgA肾病的发生显著相关，而Megsin C25663G、23179 9T/10T、T23381C和C23415T多态性与中国汉族人群IgA肾病的发生无关。 3．中国汉族人群Megsin基因2093C-2180T与lgA肾病患者临床、病理和预后的关系 [目的]了解Megsin基因C2093T和C2180T多态性与中国汉族人群IgA肾病患者临床表现、肾组织病理改变和预后的关系。[方法]收集中国汉族IgA肾病患者临床和病理资料，随访病人，根据病情是否稳定、血压、24小时尿蛋白、肾组织学改变的Lee’S分级分别对患者进行分组，计算并比较各组Megsin基因C2093T-C2180T单倍型分布频率的差异。[结果]在IgA肾病进展组和稳定组、高血压组和非高血压组、24hUP≥2g/d组和24hUP<2g/d组及不同程度病理改变组之间，Megsin基因C2093T—C2180T四种单倍型分布频率的差异均有显著性(P<0.05)。其中2093C-2180T在病情进展组、高血压组、24hUP≥2g/d组和肾组织病理分级LeeS IV+V组的分布频率显著高于其相应对照组(P<0.05)。[结论]Megsin基因C2093T和C2180T多态性与中国汉族人群IgA肾病患者肾组织病理改变和临床表现显著相关，单倍型2093C-2180T的过度传递与严重肾组织病理损害、高血压、大量蛋白尿和病情进展显著相关。 实验二、转染Megsin基因对体外系膜细胞增殖和分泌功能的影响 [目的]了解Megsin基因高表达对体外系膜细胞增殖和细胞外基质积聚的影响并初步探讨其机制。[方法]构建Megsin基因真核表达载体，体外转染培养的大鼠系膜细胞，应用<3>H-胸腺嘧啶(<3>H-TdR)掺入法检测系膜细胞增殖情况、RT-PCR和ELISA法检测系膜细胞PDG-BB、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β<,1>和TNF-a mRNA的表达及细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β<,1>和Ⅳ型胶原的分泌水平。检测PDGF-BB中和抗体对大鼠系膜细胞转染Megsin基因后细胞增殖和TGF-β<,1> mRNA表达的影响。[结果]大鼠系膜细胞转染Megsin基因后细胞内<3>H-TdR的掺入量显著增加，PDGF-BB和TGF-β<,1> mRNA的表达显著上调，细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β<,1>和Ⅳ型胶原的浓度显著升高，且三者与转染Megsin基因呈明显时间依赖性关系。PDGF-BB中和抗体可显著抑制系膜细胞转染Megsin基因后细胞的增殖反应，下调胞TGF-β<,1> mRNA的表达。转染Megsin基因对系膜细胞IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α mRNA的表达无显著影响。 [结论]Megsin基因高表达在体外可显著促进大鼠系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌，细胞PDGF-BB和TGF-β<,1>的表达、分泌显著升高。其中PDGF-BB表达、分泌的升高对系膜细胞增殖和细胞TGF-β<,1>的表达具有显著促进作用。 总结： 根据以上研究结果，可以发现： 1．中国汉族人群Megsin基因变异与高加索人群存在较大差别，可能与中国汉族人群对IgA肾病的高易感性具有重要联系。 2．中国汉族人群Megsin基因A23167G多态性与IgA肾病的发生显著相关，其中G等位基因存在从父母到IgA肾病患者的过度传递。Megsin C25663G、23179 9T／10T、T23381C和C23415T多态性与中国汉族人群IgA肾病的发生无关。 3．Megsin基因C2093T和C2180T多态性与中国汉族人群IgA肾病患者肾组织病理改变和临床表现显著相关，单倍型2093C-2180T的过度传递与患者肾组织严重病理损害、高血压、大量蛋白尿和病情进展显著相关。 4．Megsin基因高表达可显著促进体外培养的大鼠系膜细胞PDGF-BB和TGF-β<,1>的表达和分泌，刺激系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌。PDGF-BB和TGF-β<,1>可能是介导Megsin基因促进系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的主要细胞因子，其中PDGF-BB表达和分泌的增加对系膜细胞增殖、TGF-β<,1>的表达均具有显著促进作用。