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目的:鉴于OmpR与伤寒沙门菌感染过程中各种应激微环境下的毒力和生存能力密切相关,本研究选取特定应激微环境下的毒力相关基因为研究对象,旨在阐明在该应激微环境下OmpR对其的转录调控机制,从而认识OmpR是如何通过相关基因的表达控制伤寒沙门菌在特定应激微环境下的毒力和生存能力,为了解伤寒沙门菌的感染和致病机制奠定一定的理论基础。方法:1.OmpR基因缺失回补株的制备:构建含有OmpR目的片段的重组载体,所用质粒为p BAD33,将重组载体电转入(35)OmpR,即可得OmpR基因缺失回补株(记为C-(35)OmpR)。同时将空载体p BAD33电转入WT和(35)OmpR中作为相应的对照株(分别记为WT-p BAD33和(35)OmpR-p BAD33)。2.生长曲线测定:以OD600数值作纵坐标,以时间作横坐标,每隔1h检测OD600值绘制生长曲线,观测WT-p BAD、ΔOmpR-p BAD和C-ΔOmpR对数中期(OD600=0.8)时在酸应激条件下的生长情况,以及WT、ΔOmpR和Δhfq在低渗条件下的生长情况。3.实时定量PCR实验检测基因转录水平:提取相应菌株总RNA并逆转录为c DNA进行实时定量PCR实验检测相应基因的m RNA水平。4.Lac Z基因融合实验:将相应基因的启动子区域克隆至p HRP309质粒β-半乳糖苷酶基因上游不含启动子区域的两个酶切位点之间,将重组质粒分别电转至WT和ΔOmpR中,比较它们的β-半乳糖苷酶活性。5.OmpR蛋白的表达及纯化:用IPTG诱导前期构建的OmpR-p ET28a-BL21菌株OmpR蛋白的表达,超声仪碎菌后离心收集上清,利用Ni亲和层析柱法分离及纯化His-OmpR蛋白,分装保存于-80°C冰箱。6.电泳迁移率实验:将体外磷酸化的His-OmpR蛋白与相应DNA启动子片段共孵育,用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行冰浴下的电泳迁移率实验,凝胶成像系统分析OmpR与相应DNA片段的结合情况。7.He La上皮细胞侵袭实验:将WT-p BAD33、(35)OmpR-p BAD33和C-(35)OmpR培养至对数早期(OD600≈0.4),按照MOI为20:1的比例分别与He La细胞共孵育90 min,弃上清液,PBS洗涤。一半孔内加入0.5%(v/v)Triton X-100裂解细胞后涂于LB氯霉素抗性平板培养过夜,计数菌落数记为T0;另一半孔内加入100μg/m L庆大霉素继续培养90 min,加入0.5%(v/v)Triton X-100裂解细胞后涂于LB氯霉素抗性平板培养过夜,计数菌落数记为T90,T90/T0表示S.Typhi对He La上皮细胞的侵袭力。8.THP-1巨噬细胞胞内生存实验:分别将WT-p BAD33、(35)OmpR-p BAD33和C-(35)OmpR培养至对数早期(OD600≈0.4),加入培养有THP-1细胞的细胞孔板中。细胞培养箱培养1 h后加入庆大霉素,继续培养1 h后裂解其中1/3孔的细胞后涂于LB氯霉素抗性平板培养过夜,计数菌落数记为T0;另2/3孔的细胞继续培养12 h和24 h,裂解细胞后涂于LB氯霉素抗性平板过夜培养,计数菌落数分别记为T12和T24,T12/T0和T24/T0表示S.Typhi在THP-1巨噬细胞胞内的生存力。结果:1.成功构建OmpR基因缺陷回补株、野生对照株和缺陷对照株。2.生长曲线测定结果表明,在酸应激条件下(35)OmpR-p BAD33的生长速率明显快于WT-p BAD33的生长速率,而C-(35)OmpR与WT-p BAD33的生长情况一致;在低渗条件下,(35)OmpR和(35)hfq的生长速率远低于WT的生长速率。3.实时定量PCR结果显示,酸应激条件能够促进cad B和cad C的转录,并且在该条件下OmpR能够抑制cad B和cad C的转录;OmpR响应于伤寒沙门菌中的高渗应激而促进hfq和Vi抗原相关基因的转录,而Hfq反馈抑制OmpR和Vi抗原相关基因;OmpR正向调控S.Typhi侵袭上皮细胞相关基因iag A、inv F、prg H以及S.Typhi巨噬细胞胞内生存能力相关基因ssr A、ssr B、spi C的转录。4.Lac Z基因融合实验结果显示,酸应激条件下OmpR能负向调控cad B、cad C的转录;OmpR能正向调控ssr A、ssr B和spi C的转录。5.电泳迁移率实验结果表明,OmpR能与以下基因的启动子区域直接结合,包括cad B、cad C、tvi A、OmpR、侵袭上皮细胞相关基因prg H、巨噬细胞胞内生存能力相关基因ssr A、ssr B和spi C。6.与WT-p BAD33相比,(35)OmpR-p BAD33对He La细胞的侵袭能力明显下降,C-(35)OmpR的侵袭能力部分恢复,表明OmpR可增强S.Typhi对上皮细胞的侵袭能力。7.与WT-p BAD33相比,(35)OmpR-p BAD33在THP-1巨噬细胞胞内的生存能力显著下降,C-(35)OmpR的胞内生存能力部分恢复,表明OmpR可增强S.Typhi在THP-1巨噬细胞胞内的生存能力。结论:OmpR的突变增强了酸应激条件下S.Typhi的生长,并且酸应激条件下OmpR通过与cad B、cad C启动子区域直接结合抑制它们的转录;ΔOmpR和Δhfq减弱了低渗透压培养基中S.Typhi的生长,高渗应激条件下OmpR能够促进hfq和Vi抗原相关基因的转录,而Hfq反馈抑制OmpR和Vi抗原相关基因,OmpR和Hfq都能自动正调节自身的基因转录;OmpR通过直接调节prg H和间接调节iag A和inv F,增加侵袭相关基因的表达,从而增强S.Typhi对上皮细胞的侵袭力;OmpR通过直接调节ssr A、ssr B和spi C,增加巨噬细胞胞内生存能力相关基因的表达,从而增强S.Typhi在巨噬细胞胞内的生存能力。