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原发性肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，每年新发和死亡患者均占全球总数的一半以上。根据全国肿瘤登记中心最新公布的2015年《肿瘤登记年报》数据，我国肝癌新增病例为46.61万，占所有恶性肿瘤的第4位(10.86％)，而死亡病例为42.21万，占所有癌症死亡的第3位(15.00％)，仅次于肺癌和胃癌。尽管近年来肝癌的诊断和治疗有了一定的进展，其预后仍然不理想，五年生存率极低。究其原因，大部分肝癌患者往往在疾病的晚期才被诊断出来，有些甚至发生了远端转移，因而错过了最佳治疗时机;此外，目前几乎没有针对中晚期肝癌有效的治疗手段。在这种情况下，迫切需要开发肝癌早期诊断试剂及新型靶向药物，提高治疗效率。 甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是一种分泌型的糖蛋白，通常特异性地在胚胎发育过程中的肝细胞或肝癌细胞内高表达，而在健康成体的肝细胞内不表达。AFP是目前临床上应用最广的原发性肝癌肿瘤标记物，血清中AFP水平常用于肝癌的普查、早期诊断、术后监测和随访。尽管AFP对肝癌病人的诊断灵敏度仅约60％，但它仍然是目前为止最为理想的原发性肝癌诊断的临床指标。目前研究者们正在致力于开发新的原发性肝癌辅助诊断标记物，以期联合AFP提高原发性肝癌的诊断灵敏度。此外，针对AFP蛋白的表位疫苗也在化学诱导的肝癌模型中被证实能诱导机体产生针对肝癌细胞内AFP的CD8+T细胞免疫应答。AFP抗原也被逐渐认为是肝癌免疫治疗的潜在治疗靶标。 原发性肝癌动物模型是评估肝癌靶向药物临床转化价值的理想模型。原发性肝癌模型的特点是其发生过程类似于人肝癌发生的恶性转化过程，具备正常的免疫系统，在研究肝癌进程的不同阶段的病理变化特点和疗效评估具有独特的优势。目前原发性肝癌小鼠模型建模周期长（8个月以上），迫切需要发展短期建模的小鼠肝癌模型。更重要的是，目前急缺原发性鼠肝癌筛查、诊断及疗效评估的有效检测方法，鼠AFP作为小鼠肝癌的最特异的肿瘤标记物，针对小鼠AFP建立检测方法具有熏要的研究价值。 本研究旨在获得具有诊断价值的抗小鼠AFP单克隆抗体，并在原发性小鼠肝癌模型中初步探索AFP单克隆抗体应用于肝癌检测、诊断和治疗的可行性。我们利用Gibson装配技术获得mAFP重组质粒后，体外重组表达和纯化带His标签的mAFP蛋白，并以此作为免疫原和筛选靶标，分别在Balb/c小鼠和LOU大鼠中筛选能特异性结合mAFP的单克隆抗体。本研究共制备12株稳定分泌小鼠抗mAFP和8株稳定分泌大鼠抗mAFP的单克隆抗体杂交瘤细胞株，通过间接化学发光法、原位蛋白杂交法和蛋白质免疫印迹法评估这些抗体与鼠源重组蛋白的反应性，同时采用间接免疫荧光法或蛋白质免疫印迹法分析这些抗体与稳定表达小鼠AFP的细胞株和小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的反应性。研究结果发现，大鼠抗mAFP抗体中6B8和10H3能同时与线性和构象的mAFP蛋白反应，而小鼠抗mAFP抗体中仅9G8能与线性的mAFP蛋白反应。我们也建立了基于CRISPR/Cas9基因敲除技术的原发性肝癌小鼠模型，小鼠在尾静脉高压注射p53/Pten打靶质粒4个月后即可发展成为肝癌。在该小鼠模型中证实筛选获得的6B8和10H3这两株mAFP抗体可特异性识别小鼠血清和肿瘤组织中的AFP蛋白。 综上所述，本研究制备了可特异性识别mAFP的单克隆抗体，并在不同的细胞模型和原发性肝癌小鼠模型中评估anti-mAFP单克隆抗体的应用潜能，该研究为未来鼠肝癌模型的筛查、诊断及疗效评估提供有效检测手段，为以AFP为靶标的肿瘤疫苗设计奠定了基础。