结肠癌是临床常见恶性肿瘤之一。每年约有120万新发病例，60万人死于结肠癌，在女性肿瘤发病率中高居第二，男性肿瘤发病率也排名第三位，近十年我国结肠癌发病率不断增加。由于起病隐匿，结肠癌具有发现晚，放疗、化疗、手术切除效果差，预后不良等特点。造成这种结果的主要原因为结肠癌细胞的高度侵袭能力和转移能力。目前，其侵袭转移的分子机制尚不完全明确。因此，有必要对结肠癌进行深入探索，阐明结肠癌转移侵袭的具体分子机制，为临床中结肠癌的早期诊断、转移预测和有效治疗提供新的策略。　　蛋白质乙酰化和去乙酰化的动态平衡参与肿瘤发生发展的多种重要途径，蛋白质去乙酰化的实现有赖于去乙酰化酶的催化。沉默信息调节因子2是首先发现于酵母菌种的一种高度保守的组蛋白去乙酰化酶，哺乳动物中的沉默信息调节因子2称为Sirtuins，包括SIRT1-7。研究表明，Sirtuins通过去乙酰化组蛋白和众多的非组蛋白，参与调控细胞寿命、能量代谢、炎症反应以及增殖、凋亡等。SIRT5是目前研究最少的Sirtuins家族成员。由于和其他Sirtuins的同源性，SIRT5首先被认为是一个去乙酰化酶。后来发现，其去乙酰化酶活性较低，反而具有去琥珀酰化、去丙二酰化、去戊二酰化酶活性。线粒体是存在于身体几乎所有细胞中的一种细胞器，主要负责能量生成和调节内环境稳定。作为位于线粒体内的Sirtuins家族最特殊的成员之一，SIRT5通过其多种酶活性作用于包括CPS1、细胞色素C、丙二酰辅酶A、SOD1在内的多种底物，参与线粒体内的多种代谢和细胞凋亡，起到调节线粒体代谢、细胞周期调控等多种作用。　　与一系列关于SIRT5在代谢中作用的研究相比，关于SIRT5与肿瘤关系的研究报道极少。最近一篇关于人类高分化浆液性卵巢癌的研究表明，在30％的病例中发现了SIRT5的高表达。另一研究指出，在进展期非小细胞肺癌中，发现了SIRT5的高表达，并指出通过对NRF2及其下游靶目标的作用，SIRT5有促进肺癌细胞生长、增殖、增加耐药性的作用。目前 SIRT5在结肠癌发生发展中的作用和机制的研究尚无报道。本研究旨在明确SIRT5在结肠癌中的表达情况，探讨SIRT5对结肠癌生物学表型的影响及可能的分子机制，为阐明SIRT5在结肠癌诊断、治疗中的作用提供潜在的理论基础。　　本研究首先采用RT-PCR技术、Western blotting和免疫组化染色技术等检测结肠腺癌及配对癌旁结肠黏膜组织中SIRT5 mRNA和蛋白表达水平，并分析SIRT5表达与结肠癌临床病理学参数之间的相关性；然后利用RNA干扰技术，靶向沉默SIRT5基因的表达，Western blotting检测SIRT5基因沉默效果，筛选出后续试验应用的结肠癌细胞LoVo和HCT-15；克隆形成实验检测SIRT5沉默后对结肠癌细胞增殖、流式细胞术检测SIRT5沉默后对结肠癌细胞凋亡的影响，分析SIRT5表达变化对结肠癌LoVo和HCT-15细胞增殖、凋亡的影响；接着应用细胞迁移及侵袭实验检测SIRT5沉默对结肠癌LoVo和HCT-15细胞迁移和侵袭能力的影响，同时研究SIRT5沉默对结肠癌LoVo和HCT-15细胞上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)指标蛋白（E-cadherin、N-cadherin及Vimentin)的表达以及基质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）表达水平的影响。为明确SIRT5沉默对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响是否与PTEN/AKT信号传导通路有关，我们对比了SIRT5沉默组与对照组PTEN/AKT信号通路的改变，进一步分析了试验结论所发生的分子机制，探讨其潜在的临床价值。　　总之，本实验以 SIRT5为靶点，探讨其对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响，及其可能的分子机制，共分为4个部分。　　第一部分：SIRT5在结肠癌中的表达及其预后分析　　方法　　1.收集结肠癌及癌旁组织的临床标本和相关临床病理资料，采用RT-PCR和Westen blotting实验方法检测并分析结肠癌组织、癌旁正常组织中SIRT5 mRNA和SIRT5蛋白的表达水平，采用χ2检验比较在结肠癌及癌旁组织中SIRT5mRNA和SIRT5蛋白的表达水平的差异。　　2.利用多组单因素回归分析，分析SIRT5的表达与结肠癌瘤体大小、分化程度、TNM分期及远端转移情况等临床病理特征之间有无相关性。　　结果　　1.结肠癌组织中SIRT5 mRNA、SIRT5蛋白表达水平明显高于相应的癌旁组织。　　2.免疫组化结果显示，SIRT5在结肠癌组织中的表达水平高于相应的癌旁组织，差异具有统计学意义。同时，SIRT5表达水平与结肠癌患者某些病理学特征存在相关性，具体如下：SIRT5的染色评分与瘤体大小（P=0.026）、分化程度（P=0.041）、TNM分期（P=0.005）及远端转移（P=0.018）情况密切相关，瘤体越大、分化程度约差、TNM分期越高、有远处转移的患者，癌组织中SIRT5的染色程度越明显，但SIRT5的染色程度与患者年龄（P=0.552）、性别（P=0.636）及淋巴转移（P=0.701）情况无关。　　第二部分：SIRT5沉默对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响　　方法　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表达，检测结肠癌细胞HCT-15、HT-29、SW480、LoVo中SIRT5的表达水平，筛选出沉默效果较好的LoVo细胞和HCT-15细胞用于后续试验。　　2.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表达，通过CCK-8细胞增殖检测、克隆形成实验，观察SIRT5表达变化对结肠癌细胞HCT-15和LoVo增殖、克隆形成能力的影响。　　3.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表达，流式细胞仪检测SIRT5沉默的结肠癌细胞 HCT-15和LoVo的凋亡细胞比例，观察 SIRT5表达变化对结肠癌细胞HCT-15和LoVo凋亡能力的影响。　　结果　　1. siRNA转染可成功下调SIRT5基因在结肠癌细胞中的表达水平（P<0.05）。与其他结肠癌细胞系相比，SIRT5在人结肠癌高转移细胞系LoVo中，mRNA和蛋白表达水平都呈高表达，差异存在统计学意义（P<0.01）。　　2. SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15的细胞增殖能力下降，克隆形成数目减少（P<0.05）。　　3. SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15的凋亡比例增加（P<0.05）。　　第三部分：SIRT5沉默对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响　　方法　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表达，通过Wound healing试验（划痕试验），检测SIRT5基因沉默对结肠癌细胞LoVo和HCT-15迁移能力的影响。　　2.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表达，通过Transwell侵袭试验，检测SIRT5基因沉默对结肠癌细胞LoVo和HCT-15侵袭能力的影响。　　3.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表达，通过Western Blotting法检测SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15上皮属性蛋白E-cadherin以及间质属性蛋白N-cadherin、Vimentin以及金属基质蛋白MMP2、MMP9的表达水平，评价SIRT5在结肠癌细胞上皮间质转化中的作用。　　4.所有数据均采用SPSS12.0进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验；计量资料采用t检验，P<0.05有统计学意义。　　结果　　1. SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15的迁移能力降低（P<0.05）。　　2.SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15的侵袭能力降低（P<0.05）。　　3.SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15中上皮属性蛋白E-cadherin表达升高，间质属性蛋白N-cadherin、Vimentin的表达下降，金属基质蛋白MMP2及MMP9表达降低（P<0.05）。　　第四部分：SIRT5沉默对结肠癌细胞增殖、凋亡、转移影响的机制研究　　方法　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表达，观察SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15中PTEN表达和AKT磷酸化水平的变化。　　2.通过联合干扰SIRT5、PTEN的表达，检测LoVo和HCT-15细胞中AKT磷酸化水平的改变，明确SIRT5是否通过PTEN/AKT通路影响结肠癌细胞的侵袭转移能力。　　结果　　1. SIRT5基因沉默后，结肠癌细胞LoVo和HCT-15中PTEN表达均上调，同时AKT的磷酸化的水平受到抑制（P<0.05）。　　2.联合干扰 SIRT5、PTEN的表达后，结肠癌细胞 LoVo和HCT-15中，SIRT5-shRNA稳转株中瞬时转染PTEN-siRNA组较单独SIRT5-shRNA组AKT磷酸化水平均发生上调（P<0.05）。　　结论　　1.结肠癌组织中SIRT5 mRNA、SIRT5蛋白表达水平明显高于相应的癌旁组织，且与某些病理学特征有关，SIRT5基因可在结肠癌的发生发展及侵袭迁移中发挥重要作用，成为结肠癌转移和预后评估的分子标记。　　2.沉默SIRT5可以通过调节结肠癌细胞上皮间质转化，从而抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力，可能为结肠癌治疗的潜在靶点。　　3. SIRT5可通过PTEN/AKT信号通路影响结肠癌细胞的侵袭转移能力，为结肠癌分子靶向治疗提供理论依据。