论文部分内容阅读
目的:血红素加氧酶-1（HO-1）具有抗氧化应激、抗凋亡和抗细胞早衰等细胞保护性效应，同时还具有免疫调节等作用。根据基因库中已公布的HO-1序列设计引物，采用RT-PCR技术从C57BL/6j小鼠肝脏中克隆出HO-1基因。构建携带血红素加氧酶-1（HO-1）基因的逆转录病毒载体，293T细胞内包装病毒，感染293T细胞，采用RT-PCR检测HO-1基因的表达。以期为进一步研究HO-1在化疗作用下对HSCs的保护性效应;为构建GVHD小鼠模型，提供实验依据。 材料与方法:实验动物:C57BL/6j小鼠，4周龄，雌性2只，体重20-25 g，购自贵阳医学院动物实验中心。断颈法处死小鼠，取出肝脏组织。每30-50 mg组织加入1 ml Trizol。采用RT-PCR技术从小鼠肝脏中克隆出HO-1基因。对目的片段进行割胶回收，使用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ分别对上述PCR产物和质粒pQCXIP-EGFP-C1进行酶切。对酶切产物进行回收，将酶切后的PCR产物和质粒按照3∶1的比例混合后，加入T4 DNA连接酶进行进行连接。铺平板，孵育，挑取单菌落，摇菌提质粒后进行酶切鉴定，并送测序公司进行鉴定。293T细胞内包装病毒;实时荧光定量PCR测病毒滴度，成功建立包装细胞系。感染293T细胞，采用RT-PCR检测HO-1基因的表达。 结果:酶切及序列分析证实重组逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-C1构建正确;成功建立包装细胞系，病毒滴度为:6.68×108 v.p./mL。感染293T细胞，RT-PCR检测到HO-1基因的表达。 结论:成功从小鼠肝脏中克隆出HO-1基因，成功构建了携带HO-1基因的逆转录病毒载体，并且建立包装细胞系。感染293T细胞，成功检测到HO-1基因的表达。