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pPG612是一种乳酸菌和大肠杆菌穿梭表达载体,但因其拷贝数较低,而且需要添加诱导剂才能诱导蛋白表达,不方便在生产中进行应用,因此本实验在pPG612表达载体的基础上加以改造,预期得到一个可高水平表达外源蛋白、不需添加诱导物的组成型表面表达载体。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一,该菌的致病因子是其所产生的外毒素。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素(C.perfringens alpha-toxin, CPA),它是产气荚膜梭菌最重要的致病毒素之一,利用构建的组成型乳酸菌表达载体对去毒后的α毒素进行表达,筛选高表达量的组成型乳酸菌表达载体系统,为构建新型重组乳酸菌活菌疫苗防治该病提供物质基础。本实验中,构建了一个无需诱导的可表面表达a毒素蛋白的干酪乳杆菌组成型表达载体。以pPG612载体质粒为基本框架,将其原有表达元件替换为HCE启动子、PgsA anchor、 rrnBT1T2终止子,改造后载体命名为pPG-PPT,将α毒素基因片段插入到表达载体pPG-PPT中,获得重组表达质粒pPG-PPaT,并将其电转化入干酪乳杆菌L.casei393中,获得了表面表达α毒素蛋白的重组干酪乳杆菌。重组菌经过Western blot、间接ELISA、间接免疫荧光及激光共聚焦等实验分析,结果表明α毒素蛋白获得了表面表达。为了进一步优化已构建的干酪乳杆菌组成型表达载体,以提高翻译过程中mRNA的稳定性及蛋白表达量,尝试在已构建载体的启动子下游分别插入两种已应用于原核及真核蛋白表达的翻译增强子T7g10及Q增强子,这两种增强子根据相关文献报道由生工生物工程(上海)股份有限公司合成获得,构建成两种新的重组干酪乳杆菌pPG-Ω-PPα T/L.casei393和pPG-T7g10-PP a T/L.casei393表达系统,并通过Western blot、间接ELISA、荧光定量PCR、流式细胞术、间接免疫荧光及激光共聚焦等实验分析,将其与原载体pPG-PPaT中α毒素蛋白表达量进行比较。由Western blot结果得出,重组菌pPG-T7g10-PPaT/L.casei393的α毒素蛋白表达量最高,表达效果最稳定；由间接ELISA结果分析可知,三种重组菌与对照菌之间均存在极显著差异(P<0.01),重组菌pPG-Ω-PP α T/L.casei393的a毒素蛋白表达量约是重组菌pPG-PP a T/L.casei393的2倍,重组菌pPG-T7g10-PP α T/L.casei393的a毒素蛋白表达量约是重组菌pPG-PP a T/L.casei393的11倍；由荧光定量PCR结果可知,重组菌pPG-Ω-PP α TIL.casei393和pPG-T7g10-PPα T/L.casei393相对于重组菌pPG-PPα T/L.casei393中的mRNA含量,二者均出现极显著差异(P<0.01),通过REST2009软件分析,重组菌pPG-Ω-PP α T/L.casei393中a毒素蛋白表达量约是pPG-PP α T/L.casei393的2倍,重组菌pPG-T7g10-PP α T/L.casei393约为pPG-PP a TIL.casei393的9倍；经流式细胞术结果分析,从P2区采集到有荧光信号的菌体数占总菌数的百分比,pPG-PPT/L.casei393、pPG-PP α T/L.casei393、pPG-Ω-PP a T/L.casei393pPG-T7g10-PPα T/L.casei393分别为0.7%、8.5%、10.9%、15.8%,三种重组菌依次增加,α毒素蛋白在三种重组菌菌体表面的表达量也依次增多,并且在重组菌pPG-T7g10-PPα T/L.casei393中a毒素蛋白表达量最大,三种重组菌与空载体对照菌pPG-PPT/L.casei395相比,a毒素蛋白表达量差异均极显著(P<0.01)；间接免疫荧光结果显示出,重组菌pPG-T7g10-PPα T/L.casei393表面观察到的黄绿色荧光最多。间接免疫荧光与激光共聚焦结果都显示出三种重组菌均为表面表达a毒素蛋白。在本研究中还制备了鼠抗PgsA anchor的多克隆抗体,用于与PgsA anchor融合表达的a毒素蛋白的Western blot检测,抗体效价为1：51200。通过对三种重组菌中a毒素蛋白表达效果的比较分析,以上结果均表明,重组干酪乳杆菌pPG-T7g10-PPaT/L.casei393的α毒素蛋白表达量最高,表达效果最稳定。上述结果表明,重组干酪乳杆菌表达系统pPG-PPaT/L.casei393虽然获得了α毒素蛋白的表达,但是其表达效果并不理想,蛋白表达量较低而且表达效果不够稳定,但在插入了翻译增强子T7g10及Q增强子的表达载体pPG-Ω-PPaT和pPG-T7g10-PPaT中,α毒素蛋白的表达量得到了显著提高,而且插入T7g10增强子的重组质粒表达载体在L.casei393中稳定性较高且蛋白表达情况比较理想,但插入Ω增强子的表达载体相比较而言,其稳定性较差。综上所述,重组干酪乳杆菌pPG-T7g10-PPT/L. casei393表达系统可为用于蛋白表面表达无需添加诱导剂诱导的外源蛋白组成型表达系统的建立提供参考。该重组干酪乳杆菌也可通过发酵罐培养获取大量表达的外源蛋白,而且与诱导型表达系统相比,其操作简单,可降低工业生产成本,应用前景更为广阔。