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研究表明,IL-4受体（Interleukin-4 Recepter,IL-4R）分为两型,I型受体由IL-4Rα亚基和γc亚基组成,II型受体由IL-4Rα亚基和IL-13Rα1亚基组成[1]。其中,IL-4可以与IL-4RI型受体和II型受体结合,IL-13可以与IL-4RII型受体和IL-13Rα2亚基结合,二者均可通过与相应受体结合后激活STAT6信号通路从而发挥生物学效应[2,3]。而IL-4和IL-13的受体复合物有一个共同的组成部分IL-4Rα,所以,阻断IL-4Rα可以同时阻断IL-4和IL-13通过I型受体和II型受体发挥作用,从而阻断辅助型T细胞（T helper 2 cell,Th2）扮演关键角色的炎症通路。本课题首先从NCBI上获取人源IL-4Rα全长氨基酸序列（NP.000409.1）,使用Uniprot数据库和TMHMM Server v.2.0膜外段分析软件分析出IL-4Rα胞外段,将获取的目的序列添加相应的酶切位点、信号肽和His标签,并克隆至pc DNA3.1（+）表达载体,将得到的重组表达质粒进行双酶切验证。取酶切验证正确的IL-4Rα重组表达质粒瞬时转染Expi293F细胞,当细胞活率降至65%～75%时收获细胞上清并纯化。将纯化后的蛋白使用Pierce?BCA蛋白定量分析试剂盒检测蛋白浓度,采用十二烷基硫酸钠凝胶电泳法（Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE）分析蛋白纯度,蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）检测蛋白特异性。将经过纯化和鉴定后的IL-4Rα胞外段作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并加入促融合剂聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）制备杂交瘤细胞。再通过ELISA筛选出具有结合活性和阻断活性的杂交瘤细胞株,再对细胞株进行连续3次亚克隆。选取结合活性和阻断活性最高的1株杂交瘤细胞进行扩大培养,通过体内法制备单抗腹水,再采用辛酸-硫酸铵法对腹水中的单抗进行纯化。使用ELISA试剂盒检测单抗的亚类和亚型,SDS-PAGE和分子排阻色谱法（Size exclusion HPLC,SEC-HPLC）分析单抗的纯度,WB检测单抗特异性,ELISA检测单抗结合活性和阻断活性,流式细胞法和细胞增殖抑制法检测单抗的阻断活性。最后,提取杂交瘤单克隆细胞总m RNA,将m RNA反转录成第一链c DNA,根据单抗的亚类和亚型设计PCR引物并进行PCR扩增,并将PCR产物送测序,将测序结果经过同源性及CDR区分析后,将钓取的鼠源单抗重轻链可变区序列与人的恒定区序列分别进行拼接,并克隆至pc DNA3.4表达载体。双酶切验证质粒构建正确后,瞬时转染Expi293F细胞,收获细胞上清并纯化,得到抗IL-4Rα人鼠嵌合单抗。将纯化后的抗体使用SDS-PAGE分析纯度,ELISA检测结合活性和阻断活性。本课题成功构建了IL-4Rα/pc DNA3.1（+）重组表达质粒,瞬时转染了Expi293F细胞后,对上清中的的蛋白经镍柱进行亲和纯化。经BCA法检测蛋白浓度约为2 mg/m L,SDS-PAGE和WB分析结果显示在相对分子质量40 000～55000大小处出现明显特异性条带,糖基化酶切的蛋白在相对分子质量约30 000大小处出现均一的条带,与蛋白理论分子量一致,证明蛋白成功表达,表达量约为66 mg/L。经过小鼠免疫和细胞融合后,通过ELISA筛选出2株具有结合活性和阻断活性的单克隆细胞株,分别命名为6-G2和2-E10,其中,6-G2单抗具有相对较高的结合活性和阻断活性。经亚类（型）鉴定试剂盒检测6-G2单抗的亚类为Ig G1,轻链为κ链。c IEF检测结果显示该单抗的等电点约为5.9。SDS-PAGE后使用Alpha View SA软件扫描,结果显示,单抗的还原型纯度在95%以上,非还原型纯度大于93%。WB检测结果显示,6-G2单抗在理论分子量处出现明显条带,表明该单抗结合的是IL-4Rα上的线性表位ELISA检测结果显示6-G2单抗结合活性半数有效浓度(50%Effective concentration,EC50)为10 ng/m L;ELISA阻断活性实验结果显示6-G2单抗对IL-4的最高抑制率为27%;流式细胞法检测结果显示6-G2单抗可以完全阻断IL-13与横纹肌瘤（Rhabdomyomas,RD）细胞的结合;细胞增殖抑制实验结果显示,6-G2单抗可完全阻断IL-4和IL-13与IL-4R的结合,进而抑制细胞的增殖。提取了6-G2单抗杂交瘤细胞总m RNA并逆转录后,我们成功钓取了抗体重轻链序列,比对结果显示,其为典型的鼠源单抗序列。酶切及测序验证结果表明,成功构建了人鼠嵌合单抗（ch6-G2）重组表达质粒。转染后的细胞上清鉴定结果表明,ch6-G2单抗成功表达。SDS-PAGE结果显示,ch6-G2单抗的还原型纯度在95%以上,非还原纯度在93%以上。ELISA结合活性结果显示,ch6-G2与IL-4Rα的结合活性EC50为117 ng/m L。综上,本课题表达并制备了纯度大于95%的IL-4Rα,筛选制备了抗IL-4Rα的鼠源单克隆杂交瘤细胞株,并对一株具有较高结合与阻断活性的鼠源单抗进行了全面鉴定及人鼠嵌合改造,为后续开发针对抗IL-4Rα的人源化治疗性单抗药物奠定了基础。