噎膈血瘀型患者血清对食管癌EC9706细胞PI3K/AKT信号通路和细胞周期的影响

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目的以食管癌EC9706细胞建立体外模型,观察中医临床确诊的食管癌血瘀型(噎嗝血瘀型)患者血清对离体癌细胞具有促增殖/抑制作用;分析噎嗝血瘀型患者血清对食管癌细胞周期的影响;探讨中医噎膈血瘀型患者血清对EC9706细胞PI3K/AKT信号通路的影响;以期揭示血液内环境对食管癌发生及中医噎嗝血瘀证形成中的分子机制。方法将EC9706细胞接种于Φ100mm培养皿中,以10%小牛血清DMEM培养液培养,温度设定在37℃,饱和湿度为5%的CO2培养箱孵育,细胞贴壁24h,饥饿24h,分别加入食管癌血瘀型患者血清(T组)、脾气虚型患者血清(Q组)和健康志愿者血清(P组)的培养液,设置6个梯度患者血清浓度为31.25,62.5,125,250,500,1000μl/10ml培养液体积,空白对照组(C组)加完全自由培养基。孵育48h后,利用MTT比色法检测细胞增殖变化、光镜观察细胞形态变化、运用流式细胞技术(FCM)测定细胞周期,免疫印迹法观察PI3K/Akt信号通路蛋白表达变化。结果1噎嗝血瘀型患者血清对食管鳞癌EC9706细胞生长半数增殖浓度(PI50):各组人血清均对细胞增殖具有刺激作用,血清浓度与细胞增殖率呈正相关,应用F检验,拟合曲线方程,得出T组PI50=840μl/10ml培养液体积,Q组PI50=1180μl/10ml培养液体积,P组PI50=1243μl/10ml培养液体积。2噎嗝血瘀型患者血清对食管鳞癌EC9706细胞形态的影响:与C组相比,T组、Q组和P组细胞增长迅速,形体偏大、饱满,细胞间隙缩小;培养基内细胞汇合率高,表现在细胞数目和形态上有很大差异。Q组、P组细胞连接不甚紧密,T组细胞连接成网状。3噎嗝血瘀型患者血清对食管鳞癌EC9706细胞周期的影响:流式细胞术测定细胞周期显示T组细胞S期(增殖期)所占百分比为(38.85±3.11)%,与C组相比有显著性差异(P<0.05)。4噎嗝血瘀型患者血清对食管鳞癌EC9706细胞PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响:Western blot法检测显示应用噎嗝血瘀型患者血清处理的EC9706细胞,PI3K/AKT信号通路各蛋白条带与各对照组相比增强,说明噎嗝血瘀型患者血清对其表达具有一定的促进作用,各组蛋白表达强度依次为T>Q>P>C。结论1噎膈血瘀证患者血清刺激EC9706细胞增殖与诱导细胞进入S增殖期、增强PI3K/AKT信号通路蛋白表达有关。2噎膈血瘀证患者血液微环境是食管癌得以发生发展的重要因素。
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