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口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。FM D呈全球性流行,传播迅速,覆盖面广,每次暴发流行都会给当地的畜牧业带来近乎灾难性的经济损失。FMD被世界动物卫生组织列为法定报告动物疫病,是国际兽医局规定的必报传染病,也被我国认定为一类传染病。3C蛋白酶是所有微RNA科病毒的共有裂解酶,在多聚蛋白的转录和翻译过程中起着十分重要的作用,有研究表明3C蛋白酶能对宿主细胞中某些维持正常生理活动的蛋白质进行破坏,是宿主细胞内重要的毒力因子。FMDV 3C蛋白酶在FMDV的致病过程中起着十分重要的作用,它可以切割自身编码的多聚蛋白以及宿主细胞蛋白并且调控宿主细胞蛋白的转录和翻译,从而能够抑制宿主免疫,是目前抗FMDV研究的重要靶点。本研究通过克隆FMDV 3C基因,构建其原核表达质粒并诱导表达,然后将表达的3C重组蛋白纯化后免疫兔子来制备3C蛋白多克隆抗体,将制备的多克隆抗体利用间接ELISA以及Western blotting检测其对重组蛋白的效价和特异性,结果显示效价和特异性较高,并将该多克隆抗体通过IFA和Western blotting应用于3C的检测,为口蹄疫及其3C蛋白的相关研究提供了重要的试验工具。首先构建表达载体pET-28a-3C:通过NCBI数据库中提供的FMDV 3C的序列,设计带有酶切位点的特异性引物,以实验室保存的PXJ-3C质粒为模板,采用PCR方法使用该特异性引物扩增口蹄疫病毒3C基因,将其连接到PXJ载体上,测序正确后再用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切法插入pET-28a克隆位点,成功构建重组原核表达质粒pET-28a-3C。然后进行重组蛋白的诱导表达:将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞,获得含重组质粒的表达菌株。使用合适浓度的IPTG进行诱导表达。表达产物经过SDS-PAGE和Western blotting分析显示,FMDV 3C的重组蛋白的表达形式为可溶性蛋白。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱以及Millipore超滤管纯化重组蛋白,跑SD S-PAGE胶检测其纯度,最终获得纯度和浓度达到免疫要求的有活性的免疫原。最后制备及鉴定多克隆抗体:采用皮下免疫法将纯化的3C重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,经过三次免疫后心脏采血,分离血清并将其过重组蛋白G琼脂糖凝胶FF进行纯化。通过Western blotting和ELISA检测多克隆抗体血清的特异性和效价,产生的抗体能与原核表达蛋白发生反应,同时抗体在稀释比例为1:128000和1:256000情况下都能与原核表达蛋白发生特异性反应,成功制备获得了反应性和特异性较高的多克隆抗体。进一步通过细胞间接免疫荧光实验和Western blotting检测该多抗可以和真核质粒表达的3C蛋白特异性反应。