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青虾,学名日本沼虾(Macmbrachium nipponense),隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda),长臂虾科(Palaemonidae),沼虾属(Macrobrachium),主要分布在中国、日本、朝鲜半岛和越南北部等国家的淡水水域。青虾具有生长快、繁殖力强、适应性广、经济价值高等特点,是我国淡水养殖的主要品种之一。近年来青虾相关重要功能基因被广泛研究,同时也是本实验室的科研重点。目前本实验室已对与生殖、生长和性别相关的GIH、Vg、VgR、IAG等近20个功能基因进行了系统的科学研究。已报道,蜕皮启动激素受体(Ecdysistriggering hormone receptor,ETHR)在昆虫蜕皮过程中发挥重要作用,生殖母细胞特有因子1(Gametocyte-specific factor 1,Gtsfl)在调控昆虫和哺乳动物生殖细胞发育中具有重要功能,但在青虾中未见上述2个基因相关研究的报道。本文从本实验室构建的青虾精卵巢表达谱中筛选得到ETHR和Gtsf1的同源EST序列,在此基础上进行cDNA克隆、成体组织和发育过程表达模式分析以及RNA干扰研究,以阐明ETHR和Gtsf1在青虾中承担的功能,藉此推动青虾蜕皮和生殖细胞发育机制的研究。ETHR是一种G蛋白偶联受体,它在昆虫蜕皮过程中发挥着重要的生理作用,但在甲壳动物中未见相关研究报道。采用RACE技术克隆获得青虾ETHR基因cDNA序列长 1349 bp(Gen Bank 登录号:KU532132),开放阅读框(Open reading frame,ORF)为1173 bp,编码390个氨基酸。生物信息学分析预测青虾ETHR蛋白包含七个跨膜结构域和在节肢动物中高度保守的特定功能位点,并发现该蛋白无信号肽,属于非分泌蛋白。系统进化树分析表明青虾ETHR蛋白与甲壳纲的大型水蚤(Daphnia magna)亲缘关系最近。十个不同组织中的表达分析结果显示,在脑组织中表达最高,表明大脑是ETHR活动的重要功能场所。胚胎不同发育时期表达结果显示,ETHR基因在胚胎发育早期表达水平较低(卵裂、囊胚、原肠胚期),在无节幼体期逐渐增加,到蚤状幼体阶段ETHR基因的表达量显著增加(P<0.05),出膜后表达量急剧升高(P<0.05)。蜕皮周期表达结果发现,在脑组织和表皮中均发现ETHR在蜕皮前期迅速上升(P<0.05),蜕皮后ETHR又恢复到较低水平,说明ETHR与青虾蜕皮密切相关。RNA干扰降低了 ETHR的表达量,并使实验组青虾蜕皮频率降低,约为对照组的一半,表明ETHR具有促进青虾蜕皮的作用。眼柄摘除能显著提升ETHRmRNA的表达,同时蜕皮频率在眼柄摘除后升高了 30%,表明眼柄对ETHR基因表达和蜕皮具有抑制作用。Gtsf1基因参与果蝇和小鼠的性腺发育调控,在维持生殖细胞正常生成中发挥着重要作用,但在甲壳动物中未见研究报道。为了研究青虾性早熟现象,本文采用RACE技术克隆获得青虾Gtsf1基因cDNA序列长349 bp((GenBank登录号:KR349325),开放阅读框(Open reading frame,ORF)为240 bp,编码79个氦基酸。生物信息学分析预测青虾Gtsf1蛋白包含1个zf-U11-48K结构域,并发现该蛋白无信号肽,属于非分泌蛋白。系统进化树分析表明Gtsf1基因青虾Gtsf1蛋白与昆虫纲的蝽类(Lygus hesperus)亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,Gtsf1基因在性腺中表达很高,特别是在卵巢中表达最高(为精巢的6倍),其他组织中表达极低。卵巢不同发育时期表达结果发现,发育初期Gtsf1基因表达水平较低,随着卵巢的发育,该基因的表达水平呈现显著上升趋势(P<0.05),在成熟期达到最高峰,在消退期显著下降并恢复到较低水平(P<0.05)。胚胎和胚后不同发育时期结果显示,Gtsf1基因在胚胎发育早期表达水平较高,囊胚期时显著升高并达到峰值(P<0.05),从原肠期显著下降直至变态后第10天该基因表达水平维持较低水平(P<0.05)。以上研究结果表明Gtsf1基因与生殖密切相关,特别是在卵巢发育过程中有关,且呈正相关趋势。同时,Gtsf1基因可能主要参与青虾胚胎早期发育的调控。研究首次在甲壳动物中克隆获得Gtsf1基因,并分析Gtsf1基因在青虾中的时空表达模式,研究结果为进一步研究Gtsf1基因在青虾的功能奠定了基础。