目的:ARHGAP5基因位于人类染色体的14q12区,其编码的蛋白质p190B RhoGAP(p190-B)为GAP家族重要的成员之一。p190-B可以调控small GTPase分子如:RhoA,Rac1以及cdc42的活性状态,参与调控细胞骨架的重塑、细胞粘附及极性的维持以及细胞迁移等过程,从而在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用。　　 目前有关p190-B的研究主要见于乳腺癌。p190-B不仅在乳腺的分枝形态形成过程中起着关键作用,而且在乳腺癌的发生发展过程中同样重要。此外,一些研究提示,在肝癌和食管癌细胞株中14q12区表现为异常扩增,并且证实ARHGAP5为该区域内最显著扩增的基因之一。在人非小细胞肺癌(NSCLC)中此区也是异常扩增的区域。但是目前有关ARHGAP5以及其编码蛋白p190-B在NSCLC中的研究尚未见详细报道。　　 我们前期的研究表明,在人原发非小细胞肺癌组织中p190-B的表达明显高于相应的正常肺组织中,并且其表达与淋巴结转移及患者临床TNM分期呈正相关,提示p190-B可能与非小细胞肺癌的侵袭与转移相关。为了进一步探讨p190-B在NSCLC发生和发展过程中的作用及可能机制,本研究构建了ARHGAP5真核表达载体,转染非小细胞肺癌细胞株H1299细胞,观察所构建质粒在细胞中的表达活性,从而为进一步的研究奠定基础。　　 方法:　　 1真核表达载体pARHGAP5的构建　　 分别提取A549细胞DNA和RNA,经PCR方法扩增ARHGAP5基因片段p1和p2。之后采用重叠延伸PCR(GENE SPLICING BY OVERLAPEXTENSION PCR,SOE-PCR)方法,以片段p1和p2为模板扩增获得ARHGAP5 mRNA全长编码序列。进一步克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His B,得到重组表达质粒pARHGAP5。　　 2真核表达载体pARHGAP5表达活性的检测　　 将pARHGAP5用脂质体的方法转染H1299细胞,采用real-time PCR以及Western blot方法,观察ARHGAP5 mRNA以及p190B蛋白在细胞中的表达情况,对真核表达载体pARHGAP5的性进行评价。　　 结果:　　 1.ARHGAP5 mRNA全长编码序列的获得　　 以A549细胞DNA为模板,经PCR扩增获得ARHGAP5基因片段p1(3717bp)。以总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得ARHGAP5基因片段p2(848bp)。之后,以片段p1和p2为模板,等量加入体系中进行重叠延伸PCR反应,扩增得到ARHGAP5 mRNA全长编码序列,片段长度为4524bp。　　 2.真核表达载体pARHGAP5的构建　　 将真核表达载体pCDNA3.1/v5-hisB和上述ARHGAP5产物分别进行双酶切,经连接、转化以及克隆筛选。所得质粒经酶切鉴定以及PCR鉴定后,将阳性克隆进行测序验证。将序列进行Blast,证实序列与GenBank(NM_001030055.1)提供的氨基酸序列完全一致,证明真核表达载体pARHGAP5构建成功。　　 3.pARHGAP5在人非小细胞肺癌H1299细胞中的有效表达　　 将pARHGAP5转染细胞,于转染后48 h收集细胞检测ARHGAP5mRNA及p190-B蛋白的表达情况。Western blot结果表明,在pARHGAP5转染组细胞中p190-B蛋白呈显著过表达。Real-time PCR方法也表明了转染后ARHGAP5 mRNA的表达较空载体组增加了近50倍。说明pARHGAP5质粒可在细胞中良好表达。　　 结论:　　 1.分别以DNA和RNA为模板,经PCR和RT-PCR方法获得ARHGAP5　　 mRNA的两个片段,并进一步经SOE-PCR技术获得了全长编码序列,为大片段基因克隆的实现奠定了基础。　　 2.经测序鉴定,证实我们成功克隆了真核表达载体pARHGAP5。　　 3.所构建的表达载体pARHGAP5能在H1299细胞中有效表达。研究结果为深入探讨p190-B在非小细胞肺癌的发生及进展中的作用及其相关机制提供了可能。