微孢子虫(Microsporidia)为专性寄生的单细胞真核生物,具有广泛的寄生域,能感染大部分脊椎动物与无脊椎动物,自N?geli在1857年首次鉴定家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)后,目前已被报道的微孢子虫约有1 500多种,187个属。作为经济类昆虫家蚕的病原微生物,家蚕微孢子虫常常给蚕业生产带来巨大的经济损失。目前关于家蚕微孢子虫中大分子转运的方面研究甚少,核孔蛋白(nucleoporins,Nups)与蛋白转运蛋白(protein transporter)都是参与真核细胞体内物质运输的重要蛋白,Nup170与Nup98作为核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)的重要组成部分,主要参与大分子物质在细胞核与细胞质之间的运输,而Sec23蛋白作为细胞质被膜复合体Ⅱ(coat protein complex Ⅱ,COPⅡ)组装所必需的的结构蛋白,保证了大分子物质在高尔基体与内质网间的有序转运过程。Nup170是NPC的重要结构成分之一,是维护其结构稳定所必需的。生物信息学分析可知家蚕微孢子虫中存在Nup170蛋白,NbNup170基因包含一个长度为762 bp的ORF,编码253个氨基酸残基。预测的NbNup170蛋白分子质量为29.38 k D,等电点为8.28,有1个N-糖基化位点和2个磷酸化位点,亚细胞定位预测结果显示分布在细胞核上。预测家蚕微孢子虫Nup170蛋白的三维结构为椭圆形的,酿酒酵母中为新月形。系统发育分析表明,家蚕微孢子虫与其他微孢子虫聚集在同一分支上,并且与Nosema apis和Nosema ceranae密切相关。NbNup170蛋白在家蚕微孢子虫的休眠孢子中主要定位在质膜上,随着孢子发芽通过极管与孢原质一同弹出并进入宿主细胞。NbNup170蛋白在家蚕微孢子虫的裂殖增殖期分布在核外两侧和核膜上,在孢子形成期主要分布在核膜上,可能与NPC的组装和核膜的形成有关。q PCR结果显示,感染后30 h至78 h内,NbNup170基因的相对表达水平一直在较低水平,然后在102 h迅速达到最高值,而RNA干扰后NbNup170的相对表达活性始终保持在较低水平,表明RNA干扰显著下调了NbNup170基因的表达。Nup98和Nup96是由同一个基因编码的两种功能不同的蛋白,是组成NPC的主要核孔蛋白。生物信息学分析可知家蚕微孢子虫中存在NbNup98蛋白,NbNup98基因包含一个长度为2 013 bp的ORF,编码670个氨基酸残基。预测的NbNup98蛋白分子质量为71 k D,等电点为9.29。有64个磷酸化位点、7个N-糖基化位点。免疫荧光实验结果表明,家蚕微孢子虫的成熟孢子中存在NbNup98蛋白,会随着孢子发芽通过极管与孢原质一同弹出并进入宿主细胞。NbNup98蛋白在家蚕微孢子虫的裂殖增殖期主要分布在孢子核外两侧和核膜上,可能与核分裂有关。在孢子形成期主要分布在核膜上,可能涉及蛋白质和RNA的转运过程。作为构成COPⅡ的重要组分,Sec23蛋白可以将COPⅡ中的的不同组分紧密联系在一起,保证COPⅡ小泡的有序组装。本研究首次鉴定了家蚕微孢子虫Sec23蛋白。生物信息学分析显示,NbSec23基因包含一个长度为540 bp的ORF,编码179个氨基酸残基。预测的NbSec23蛋白等电点为4.93,蛋白分子质量为20.75 k D。有4个磷酸化位点和3个N-糖基化位点,亚细胞定位预测结果显示分布在细胞质。系统发育分析表明家蚕微孢子虫Sec23蛋白与其它微孢子虫同源性较高,可能拥有共同的进化起源。本文首次成功克隆了NbNup170、NbNup98和NbSec23基因,鉴定并表达了重组蛋白,对NbNup170和NbNup98的定位进行了研究,为进一步探索NbNup170、NbNup98和NbSec23蛋白,以及NPC和COPⅡ在家蚕微孢子虫中的功能研究奠定了基础。NbNup170和NbNup98蛋白在家蚕微孢子虫的整个生活史中都一直存在,但在不同的发育阶段定位不同,这可能是通过与其它蛋白的相互作用而实现,这也将是下一步研究的重点。