稳定表达猪干扰素调节因子7细胞株的建立及表达产物转位研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:doudou2008
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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classica Swine Fever Virus, CSFV)引起的猪的一种接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病之一。近年来猪瘟的发病趋向于非典型性和温和型,对猪瘟的防控带来了新的挑战。干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor3, IRF3)与干扰素调节因子7(InterferonRegulatory Factor7, IRF7)是宿主应答CSFV的重要细胞因子,它们的激活可以启动干扰素(Interferon, IFN)的转录。已有研究表明CSFV的Npro蛋白可以降解猪干扰素调节因子3(porcine IRF3, pIRF3),这样就抑制了宿主对CSFV的免疫应答。而CSFV对猪干扰素调节因子7(porcine IRF7, pIRF7)的作用尚不明确。本研究构建了pIRF7的真核表达载体;建立了检测pIRF7基因的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,Real-time qPCR)方法并利用该方法检测了CSFV石门株感染ST细胞后细胞内pIRF7的转录水平的变化;筛选得到了稳定表达重组pIRF7蛋白的猪睾丸(ST)细胞株并观察了重组pIRF7蛋白的转位能力,获得了以下结果:(1)用反转录PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR)方法从猪淋巴结细胞中克隆得到pIRF7基因,将其连接到pEGFP-C3真核表达载体中,得到了重组质粒pEGFP-pIRF7。(2)利用重组质粒pEGFP-pIRF7作为标准品,绘制出了检测pIRF7基因的Real-timeqPCR方法的标准曲线,表明建立的检测pIRF7基因的Real-time qPCR方法敏感性较好(可达1.0×102个拷贝/μL)。利用该方法检测CSFV石门株感染ST细胞中pIRF7的含量。结果在感染的前期,ST细胞内pIRF7表达量基本没有变化,而在感染24h时其表达量激增。(3)将重组质粒转染于ST细胞中,通过G418加压筛选及细胞纯化获得了G418抗性的ST细胞株(STA1)。RT-PCR扩增得到1482bp的条带和Western blot检测到约90ku的蛋白,说明STA1细胞株能够稳定表达重组pIRF7,而且以聚肌胞刺激STA1细胞可以观察到表达的重组pIRF7蛋白由细胞质转移至细胞核内。本研究构建了重组质粒pEGFP-pIRF7,明确了CSFV石门株可以诱导ST细胞pIRF7基因的转录,将重组质粒pEGFP-pIRF7转染入ST细胞系得到了稳定表达重组pIRF7蛋白的STA1细胞株,并观察到表达的重组pIRF7蛋白在细胞内具有核转位能力,这种特性符合pIRF7蛋白的生物学特点,这为进一步研究CSFV与pIRF7的关系奠定了基础。
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