桃树流胶病是桃树重要病害之一,主要危害主干、主枝以及侧枝,会严重削弱树势,影响树体健康,进而可能影响果实品质和产量,当病害严重时可能会造成枯枝死树。前人研究发现湖北省桃流胶病菌鉴定为Botryosphaeria dothidea,B.obtuse,B.rhodina。其中B.dothidea分离频率最高,分布最广泛;B.rhodina仅在沙洋县发现;B.obtusa在公安县有分布。B.dothidea被确定为主要的桃流胶病菌。目前缺少快捷、可靠的桃流胶病病原菌检测方法,本课题通过设计具有B.dothidea种特异性的引物,以期构建出可靠的q PCR方法检测病部组织的病原菌DNA含量。主要研究结果如下:1.本研究找到一种适合桃枝干病部组织DNA提取的方法。该方法以改良CTAB法为基础,在提取DNA时使用组织磨样机代替人工液氮磨样,提高了提取效率。其次,在水浴样品30 min后增加离心收集上清液这一步骤。对提取的DNA进行质量检测以及PCR抑制物检测,结果显示DNA质量较高,不含有PCR抑制物。2.设计出B.dothidea的种特异性引物。根据桃流胶病菌B.dothidea、B.rhodina、B.obtusa菌株和Genbank中收录的Botryosphaeria spp.菌株的β-tubulin序列进行比对,利用Primer Premier 5.0软件设计种特异性引物对EF1/ER2。正向引物EF1:5’-TCATTCTCAGCGTGGGAGAACA-3’;反向引物ER2:5’-ACGAGGAACGTACTTGTTGTTGGA-3’将设计的种特异性引物导入Gen Bank核酸数据库进行BLAST分析,发现引物没有产生任何非特异性扩增以及其他物种的相似性较高的序列。使用B.dothidea菌株、Botryosphaeria spp.真菌菌株以及桃树上常见的桃褐腐病菌、桃灰霉病菌、桃炭疽病菌等菌株检测引物特异性,普通PCR和q PCR两种技术均证明该引物具有特异性。田间样品的q PCR扩增产物进行测序发现,扩增子序列和引物设计序列完全一致,进一步证明了q PCR检测的准确性。对B.dothidea菌株WH-2的DNA样品进行梯度稀释,同时进行q PCR和普通PCR检测,发现q PCR检测的灵敏度为1 pg。普通PCR检测的灵敏度为10 pg。q PCR检测的灵敏度是普通PCR的10倍。3.建立Ct与枝干组织中病原菌初始量的线性关系。线性回归方程为y=-3.086x+24.7,判定系数R2为0.9943。选用寄主桃TEF2基因((Translation elongation factor 2)作为内参基因,B.dothidea的β-tubulin基因作为目标基因,用特异性引物对EF1/ER2对病部组织DNA提取物进行q PCR扩增,利用△Ct法进行相对定量,得到寄主组织中B.dothidea DNA相对含量。