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目的:通过观察重症肌无力(MG)患者外周血调节性T细胞(CD4+CD25+T,Treg)内线粒体自噬,明确MG患者Treg细胞是否存在线粒体自噬异常及与Treg细胞功能的关系;采用雷帕霉素(Repa)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)体外调节Treg细胞的自噬状态,观察线粒体自噬状态对Treg细胞功能的影响;探讨Treg细胞的线粒体自噬障碍参与MG发生的细胞免疫机制。方法:1)选择经临床确诊的MG患者15例作为实验组(MG),另选未患病的正常人15例作为正常对照组(N)。2)经肱静脉采集外周血30ml,采用密度离心法分离单个核细胞,再将单个核细胞通过磁珠分选后分别获得CD4+T细胞、CD4+CD25+Treg细胞,并通过流式细胞仪鉴定上述两种细胞的纯度。3)获得的Treg细胞分别进行分组:正常对照组(N)、重症肌无力组(MG),重症肌无力Treg细胞加入Repa组(Repa)、3-MA诱导培养48h组(3-MA)。4)将所获得N和MG的CD4+CD25+Treg细胞分别通过电镜观察细胞内线粒体自噬的情况;同样将Repa组、3-MA组Treg细胞进行电镜观察细胞内线粒体自噬情况后,与MG组进行比较。5)将所获得N和MG的CD4+CD25+Treg细胞分别通过共聚焦观察细胞内线粒体与溶酶体融合的情况;Repa组、3-MA组通过共聚焦观察细胞内线粒体与溶酶体融合的情况后,与MG组进行比较。6)分别收集N、MG、Repa组、3-MA组的CD4+CD25+Treg细胞,提取蛋白,通过Western Blot检测自噬蛋白LC3-II的表达水平。7)JC-10荧光探针标记N、MG、Repa组、3-MA组CD4+CD25+Treg细胞,通过流式细胞仪分别检测各组线粒体膜电位。8)羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE,CFSE)对正常的CD4+T细胞进行标记,加入IL2、CD3、CD28进行刺激增殖,分别与N、MG、Repa组、3-MA组的CD4+CD25+Treg细胞进行共培养5天,通过流式细胞仪分别检测各组CD4+CD25+Treg细胞对正常CD4+T细胞的增殖抑制能力。结果:1)目标细胞纯度:经磁珠分选后的细胞,通过流式细胞仪鉴定所获得的目标细胞纯度较高--CD4+T细胞纯度为95%以上,CD4+CD25+Treg细胞纯度为(92.0:±3.1)%。2)线粒体自噬鉴定(电镜):电镜下观察自噬体,MG组(19.20 ±5.49)较正常对照组(25.60±7.81)的线粒体自噬发生少(P<0.05),Repa组(26.33±3.50)明显增加(P<0.05),3-MA 组(8.27±2.12)减少(P<0.05)。3)线粒体自噬鉴定(共聚焦):共聚焦下观察融合细胞与总细胞数比值,MG组(0.321 ± 0.085)线粒体(绿色)与溶酶体(红色)融合情况较正常对照组(0.603±0.133)比例低(P<0.05),Repa 组(0.495±0.139)较 MG 明显升高(P<0.05),3-MA 组(0.237±0.828)较 MG 降低(P<0.05)。4)自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平:通过WestemBlot检测显示,MG组(0.297 ±0.065)较正常对照组(0.504±0.108)明显降低(P<0.05),Repa 组(0.561 ±0.115)较 MG 明显增加(P<0.05),3-MA 组(0.146±0.490)较 MG 减少(P<0.05)。5)Treg细胞线粒体膜电位:经JC-10标记细胞流式细胞仪检测显示,MG组(9.28 ± 2.09%)较正常对照组(2.73 ± 0.617%)明显降低,Repa 组(3.21 ± 1.09%)较 MG 升高(P<0.05),3-MA 组(11.37±3.02%)较 MG 降低(尸<0.05)。6)Treg增殖抑制功能:MG患者(26.82 ± 6.25)较正常对照组(36.49 ± 5.94)明显下降(P<0.05),Repa组(40.18±4.82)较MG 组增强(P<0.05),3-MA 组(20.81 ±6.13)较 MG 组降低(P<0.05)。结论:MG患者外周血中存在Treg细胞的线粒体自噬降低,Treg细胞功能受损;Repa体外调节MG患者外周血Treg细胞后线粒体自噬增加、功能增强;3-MA体外调节MG患者外周血Treg后,线粒体自噬降低、功能也随之下降;初步阐述Treg的线粒体自噬与其功能缺陷有密切联系,提示了 Treg细胞功能异常可能存在的细胞免疫学机制。