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研究背景：儿童超重肥胖已成为重要的公共卫生问题，其发生发展受到遗传和环境因素的综合影响。生命早期1,000天内(即从受孕到出生后两岁)的营养状况可能影响个体代谢“编程”，进而对后期的体重状态产生重要影响。如孕前体重、孕期血压均可能通过改变宫内环境导致子代超重肥胖的发生，但这两个因素之间的交互作用对子代超重肥胖的影响尚未明确。母乳作为儿童生命早期的个性化营养来源，有诸多益处；然而母乳喂养持续时间对儿童超重肥胖的预防作用结论尚不统一。另外，流行病学研究中观察到孕期因素与儿童超重肥胖的关联性背后的机制尚不明确。越来越多的证据提示，表观遗传改变(如DNA甲基化等)可能起重要作用。基于以上科学问题。本文将分为以下三个部分进行探索。
第一部分孕前体重状态、孕期血压状态与婴儿期12月龄体重状态的关联
目的：探讨孕前超重肥胖、妊娠期高血压综合征与婴儿期体质指数-z评分(Body mass index z score，BMI-z score)和12月龄高体重状态的关联。
方法：研究对象来源于2009-2010年在中国沈阳、武汉和广州市建立的第1出生队列和2014-2016年在中国珠海市建立的第2出生队列。最终共有3,765对母婴纳入本研究进行合并分析(队列1中0、3、6和12月中分别为1,969、1,698、1,574和1,605对母婴；队列2中0、3、6和12月中分别为1,796、1,601、1,574和1,665对母婴)。人口学信息均通过问卷调查获得，体格测量信息由专业人员测量或者医学记录获得。
根据中国肥胖工作组超重肥胖标准，将孕前BMI≥24kg/m2的母亲判定为超重肥胖；由于缺乏蛋白尿等数据，本研究将妊娠期收缩压和/或舒张压(Systolicbloodpressure，SBP和/或Diastolicbloodpressure，DBP)≥140/90mmHg判定为妊娠期高血压综合征；按世界卫生组织儿童生长标准，将婴儿12月龄的性别、年龄别BMI≥85th百分位数判定为高体重状态。
采用广义估计方程模型，评价孕前体重状态和孕期血压状态与儿童出生、3月、6月以及12月龄BMI-z评分的相关性。利用Andersson等设计的Excel表计算两者间具有生物学意义的相加交互作用(孕前超重肥胖和妊娠期高血压综合征的相加交互作用对子代12月龄高体重状态的影响)，即超额相对危险度(Relative excess risk of interaction，RERI)和归因百分比(Attributable proportion，AP)，RERI>0或AP>0被认为交互作用具有统计学意义。
结果：控制协变量后，与孕前正常体重+孕期正常血压组比较，孕前超重肥胖+妊娠期高血压综合征组子代12月龄BMI-z评分水平高0.62个单位。孕前超重肥胖和妊娠期高血压综合征的联合作用可增加子代12月龄婴儿高体重状态的风险(Odds ratio，OR 3.10，95%CI 1.59，6.04)，其中51%(AP 0.51，95%CI 0.13， 0.89)风险归因于相加交互作用。
结论：孕前超重肥胖与妊娠期高血压综合征的交互作用对子代高体重状态有较大影响。孕前监测体重状态以及孕期监测血压状态对于预防子代高体重状态具有重要意义。
第二部分孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联
目的：探讨孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联。
方法：研究对象来源于2017-2018珠海市的横断面研究，共1,899例3岁学龄前儿童纳入本研究。人口学信息均通过问卷调查获得，体格测量数据由专业人员测量获得。按中国工作组超重肥胖标准，将孕前BMI≥24kg/m2的母亲判定为超重肥胖。依据李辉等制定的2-18岁中国儿童青少年BMI参照标准，即BMI≥同性别、年龄超重界值点(成人接轨法，BMI24)判定为学龄前儿童超重肥胖。母乳喂养(包括纯母乳喂养和混合母乳喂养)持续时间分为<6个月和≥6个月。采用限制性立方样条模型分析母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的剂量-反应关系。采用logistic回归模型分析孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联。
结果：学龄前儿童(3岁)超重肥胖率为12.2%(男生14.5%，女生9.7%)。孕前超重肥胖可显著增加学龄前儿童超重肥胖的风险(OR 2.36，95%CI 1.41， 3.94)。限制性立方样条结果显示，母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖存在非线性剂量-反应关系(P<0.001)。在母乳喂养持续时间≥6个月的组中，未见孕前超重肥胖与学龄前儿童超重肥胖的统计学关联(OR 1.70，95% CI 0.79， 3.63)。
结论：孕前超重肥胖可能是学龄前儿童超重肥胖的危险因素。保证6个月的母乳喂养对于降低儿童早期超重肥胖风险，以及部分抵消孕前超重肥胖对子代体重的不良影响至关重要。
第三部分学龄前儿童超重肥胖的脐血DNA甲基化机制研究
目的：探讨孕前BMI、脐血/孕早期母亲血全基因组DNA甲基化区域/位点和学龄前儿童BMI-z评分的线性关联；探索学龄前儿童超重肥胖组与正常体重组脐血的全基因组DNA差异甲基化区域/位点；并对上述筛选的位点进行验证。
方法：研究对象的母亲孕早期血样和脐血来源于第2出生队列且随访到3岁。选取母亲孕前体重和身高以及学龄前儿童体重和身高等信息完整的30对母亲孕早期血样、新生儿脐血进行甲基化850k芯片检测，并分别分析母亲血/脐血全基因组DNA甲基化与孕前BMI和3岁BMI-z评分的关联。选择4例超重肥胖学龄前儿童，按性别、年龄别匹配12例体重正常的儿童，分析病例和对照的脐血全基因组DNA甲基化的差异。基于上述全基因组甲基化关联和差异分析，筛选脐血相关和差异甲基化位点及附近易感区域内(100-700bp)位点进行验证。随后，基于性别、年龄别进行匹配，对10例超重肥胖和10例体重正常学龄前儿童的脐血进行分析，对上述筛选的甲基化位点和附近易感区域内位点进行验证。学龄前儿童超重肥胖依据李辉等制定的2-18岁中国儿童青少年BMI参照标准判定，即BMI≥同性别、年龄超重界值点(成人接轨法，BMI24)。
通过R语言中CHAMP包中的线性回归，分析孕前BMI、母血/脐血全基因组DNA甲基化位点和BMI-z评分的关联；CHAMP包中Bumphunter算法用于分析超重肥胖组与对照组间(4:12)脐血全基因组差异甲基化区域；CHAMP包中线性模型中的分类变量方法用于分析学龄前儿童超重肥胖组与对照组间(4:12)脐血全基因组差异甲基化位点。采用高斯模型进行广义线性回归分析验证样本中学龄前儿童超重肥胖与对照组(10:10)间筛选的脐血差异甲基化位点以及分析筛选的相关甲基化位点与孕前BMI或3岁BMI-z评分的关联。
结果：30对母亲血与脐血的全基因组DNA甲基化关联研究中，经FDR校正后，未见与孕前BMI以及3岁BMI-z评分相关的母亲血/脐血甲基化位点，但P值较小的位点(接近1×10-6)提示可能与孕前BMI或3岁BMI-z评分相关。性别、年龄别匹配的学龄前儿童超重肥胖与体重正常组(4:12)的脐血全基因组DNA甲基化关联研究结果发现59个脐血差异甲基化区域和371个差异位点。脐血差异甲基化区域主要富集于代谢通路、脂肪细胞因子通路、胰高血糖素信号通路和缺氧诱导因子-1信号通路，而差异甲基化位点主要富集于肌动蛋白骨架调控和细胞分子粘附通路。利用性别、年龄别匹配的超重肥胖与体重正常(10:10)组的脐血验证样本对以下筛选位点及附近易感区域内位点进行验证：基于30例脐血与3岁BMI-z评分全基因组甲基化关联分析中筛选的P值排在第1(FOXN3基因中的cg23501836)，第2位(ZNF264基因中的cg27437574)和第4位的位点(SKIV2L基因中的cg13015485)，和基于4例超重肥胖与12例体重正常组脐血的全基因组甲基化差异分析中筛选的4个差异甲基化位点(AHRR基因中的cg26487191、ARNT2基因中的cg16622471、SORCS2基因中的cg26686068和SMAD3基因中的cg17726760)。其中，FOXN3基因的甲基化位点cg23501836不仅与3岁BMI-z评分的脐血全基因组甲基化关联分析中P值排在第1位，且在4例超重肥胖与12例体重正常组脐血全基因组甲基化差异分析中差异也有统计学意义。10例学龄前超重肥胖与10例体重正常组脐血验证结果显示(结合全基因组甲基化关联和差异结果进行展示)，AHRR基因中的chr5:355067–355068、FOXN3基因中的chr14:89630264–89630272和chr14:89630387–89630388位点差异有统计学意义(P<0.05)。并且FOXN3基因的chr14:89630264–89630272和chr14:89630387–89630388甲基化位点与孕前BMI水平相关(P<0.05，其中孕前BMI与脐血全基因组甲基化关联分析中，FOXN3甲基化cg23501836位点的P值排在第62位)。FOXN3基因的chr14:89630264–89630272和chr14:89630295–89630296及ZNF264基因的chr19:57703104–57703107和chr19:57703301–57703307甲基化位点与3岁BMI-z评分相关(P<0.05)。
结论：本脐血全基因组DNA甲基化研究和验证结果共同提示脐血FOXN3和AHRR基因甲基化可能与儿童早期超重肥胖相关，脐血FOXN3以及ZNF264基因甲基化可能与儿童早期BMI-z评分相关，且脐血FOXN3基因甲基化与孕前BMI相关，提示其可能介导孕前BMI与儿童早期BMI-z评分或超重肥胖的关联。
第一部分孕前体重状态、孕期血压状态与婴儿期12月龄体重状态的关联
目的：探讨孕前超重肥胖、妊娠期高血压综合征与婴儿期体质指数-z评分(Body mass index z score，BMI-z score)和12月龄高体重状态的关联。
方法：研究对象来源于2009-2010年在中国沈阳、武汉和广州市建立的第1出生队列和2014-2016年在中国珠海市建立的第2出生队列。最终共有3,765对母婴纳入本研究进行合并分析(队列1中0、3、6和12月中分别为1,969、1,698、1,574和1,605对母婴；队列2中0、3、6和12月中分别为1,796、1,601、1,574和1,665对母婴)。人口学信息均通过问卷调查获得，体格测量信息由专业人员测量或者医学记录获得。
根据中国肥胖工作组超重肥胖标准，将孕前BMI≥24kg/m2的母亲判定为超重肥胖；由于缺乏蛋白尿等数据，本研究将妊娠期收缩压和/或舒张压(Systolicbloodpressure，SBP和/或Diastolicbloodpressure，DBP)≥140/90mmHg判定为妊娠期高血压综合征；按世界卫生组织儿童生长标准，将婴儿12月龄的性别、年龄别BMI≥85th百分位数判定为高体重状态。
采用广义估计方程模型，评价孕前体重状态和孕期血压状态与儿童出生、3月、6月以及12月龄BMI-z评分的相关性。利用Andersson等设计的Excel表计算两者间具有生物学意义的相加交互作用(孕前超重肥胖和妊娠期高血压综合征的相加交互作用对子代12月龄高体重状态的影响)，即超额相对危险度(Relative excess risk of interaction，RERI)和归因百分比(Attributable proportion，AP)，RERI>0或AP>0被认为交互作用具有统计学意义。
结果：控制协变量后，与孕前正常体重+孕期正常血压组比较，孕前超重肥胖+妊娠期高血压综合征组子代12月龄BMI-z评分水平高0.62个单位。孕前超重肥胖和妊娠期高血压综合征的联合作用可增加子代12月龄婴儿高体重状态的风险(Odds ratio，OR 3.10，95%CI 1.59，6.04)，其中51%(AP 0.51，95%CI 0.13， 0.89)风险归因于相加交互作用。
结论：孕前超重肥胖与妊娠期高血压综合征的交互作用对子代高体重状态有较大影响。孕前监测体重状态以及孕期监测血压状态对于预防子代高体重状态具有重要意义。
第二部分孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联
目的：探讨孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联。
方法：研究对象来源于2017-2018珠海市的横断面研究，共1,899例3岁学龄前儿童纳入本研究。人口学信息均通过问卷调查获得，体格测量数据由专业人员测量获得。按中国工作组超重肥胖标准，将孕前BMI≥24kg/m2的母亲判定为超重肥胖。依据李辉等制定的2-18岁中国儿童青少年BMI参照标准，即BMI≥同性别、年龄超重界值点(成人接轨法，BMI24)判定为学龄前儿童超重肥胖。母乳喂养(包括纯母乳喂养和混合母乳喂养)持续时间分为<6个月和≥6个月。采用限制性立方样条模型分析母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的剂量-反应关系。采用logistic回归模型分析孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联。
结果：学龄前儿童(3岁)超重肥胖率为12.2%(男生14.5%，女生9.7%)。孕前超重肥胖可显著增加学龄前儿童超重肥胖的风险(OR 2.36，95%CI 1.41， 3.94)。限制性立方样条结果显示，母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖存在非线性剂量-反应关系(P<0.001)。在母乳喂养持续时间≥6个月的组中，未见孕前超重肥胖与学龄前儿童超重肥胖的统计学关联(OR 1.70，95% CI 0.79， 3.63)。
结论：孕前超重肥胖可能是学龄前儿童超重肥胖的危险因素。保证6个月的母乳喂养对于降低儿童早期超重肥胖风险，以及部分抵消孕前超重肥胖对子代体重的不良影响至关重要。
第三部分学龄前儿童超重肥胖的脐血DNA甲基化机制研究
目的：探讨孕前BMI、脐血/孕早期母亲血全基因组DNA甲基化区域/位点和学龄前儿童BMI-z评分的线性关联；探索学龄前儿童超重肥胖组与正常体重组脐血的全基因组DNA差异甲基化区域/位点；并对上述筛选的位点进行验证。
方法：研究对象的母亲孕早期血样和脐血来源于第2出生队列且随访到3岁。选取母亲孕前体重和身高以及学龄前儿童体重和身高等信息完整的30对母亲孕早期血样、新生儿脐血进行甲基化850k芯片检测，并分别分析母亲血/脐血全基因组DNA甲基化与孕前BMI和3岁BMI-z评分的关联。选择4例超重肥胖学龄前儿童，按性别、年龄别匹配12例体重正常的儿童，分析病例和对照的脐血全基因组DNA甲基化的差异。基于上述全基因组甲基化关联和差异分析，筛选脐血相关和差异甲基化位点及附近易感区域内(100-700bp)位点进行验证。随后，基于性别、年龄别进行匹配，对10例超重肥胖和10例体重正常学龄前儿童的脐血进行分析，对上述筛选的甲基化位点和附近易感区域内位点进行验证。学龄前儿童超重肥胖依据李辉等制定的2-18岁中国儿童青少年BMI参照标准判定，即BMI≥同性别、年龄超重界值点(成人接轨法，BMI24)。
通过R语言中CHAMP包中的线性回归，分析孕前BMI、母血/脐血全基因组DNA甲基化位点和BMI-z评分的关联；CHAMP包中Bumphunter算法用于分析超重肥胖组与对照组间(4:12)脐血全基因组差异甲基化区域；CHAMP包中线性模型中的分类变量方法用于分析学龄前儿童超重肥胖组与对照组间(4:12)脐血全基因组差异甲基化位点。采用高斯模型进行广义线性回归分析验证样本中学龄前儿童超重肥胖与对照组(10:10)间筛选的脐血差异甲基化位点以及分析筛选的相关甲基化位点与孕前BMI或3岁BMI-z评分的关联。
结果：30对母亲血与脐血的全基因组DNA甲基化关联研究中，经FDR校正后，未见与孕前BMI以及3岁BMI-z评分相关的母亲血/脐血甲基化位点，但P值较小的位点(接近1×10-6)提示可能与孕前BMI或3岁BMI-z评分相关。性别、年龄别匹配的学龄前儿童超重肥胖与体重正常组(4:12)的脐血全基因组DNA甲基化关联研究结果发现59个脐血差异甲基化区域和371个差异位点。脐血差异甲基化区域主要富集于代谢通路、脂肪细胞因子通路、胰高血糖素信号通路和缺氧诱导因子-1信号通路，而差异甲基化位点主要富集于肌动蛋白骨架调控和细胞分子粘附通路。利用性别、年龄别匹配的超重肥胖与体重正常(10:10)组的脐血验证样本对以下筛选位点及附近易感区域内位点进行验证：基于30例脐血与3岁BMI-z评分全基因组甲基化关联分析中筛选的P值排在第1(FOXN3基因中的cg23501836)，第2位(ZNF264基因中的cg27437574)和第4位的位点(SKIV2L基因中的cg13015485)，和基于4例超重肥胖与12例体重正常组脐血的全基因组甲基化差异分析中筛选的4个差异甲基化位点(AHRR基因中的cg26487191、ARNT2基因中的cg16622471、SORCS2基因中的cg26686068和SMAD3基因中的cg17726760)。其中，FOXN3基因的甲基化位点cg23501836不仅与3岁BMI-z评分的脐血全基因组甲基化关联分析中P值排在第1位，且在4例超重肥胖与12例体重正常组脐血全基因组甲基化差异分析中差异也有统计学意义。10例学龄前超重肥胖与10例体重正常组脐血验证结果显示(结合全基因组甲基化关联和差异结果进行展示)，AHRR基因中的chr5:355067–355068、FOXN3基因中的chr14:89630264–89630272和chr14:89630387–89630388位点差异有统计学意义(P<0.05)。并且FOXN3基因的chr14:89630264–89630272和chr14:89630387–89630388甲基化位点与孕前BMI水平相关(P<0.05，其中孕前BMI与脐血全基因组甲基化关联分析中，FOXN3甲基化cg23501836位点的P值排在第62位)。FOXN3基因的chr14:89630264–89630272和chr14:89630295–89630296及ZNF264基因的chr19:57703104–57703107和chr19:57703301–57703307甲基化位点与3岁BMI-z评分相关(P<0.05)。
结论：本脐血全基因组DNA甲基化研究和验证结果共同提示脐血FOXN3和AHRR基因甲基化可能与儿童早期超重肥胖相关，脐血FOXN3以及ZNF264基因甲基化可能与儿童早期BMI-z评分相关，且脐血FOXN3基因甲基化与孕前BMI相关，提示其可能介导孕前BMI与儿童早期BMI-z评分或超重肥胖的关联。