背景与目的:乙肝病毒（HBV）感染是严重威胁人类健康的公共卫生问题,慢性HBV感染时,如果宿主无法产生足够的免疫应答,将形成感染后的免疫耐受。现有针对HBV感染的治疗方案仅能抑制HBV病毒的复制,难以实现慢性HBV感染的功能性治愈。在现有直接抗病毒药物的基础上,激活机体免疫系统,恢复抗乙肝病毒的免疫应答,是近年来研究的热点。固有免疫应答中的模式识别受体可以识别病原体相关分子模式,在被激活后,能够诱导I型干扰素、炎性细胞因子和干扰素刺激基因的表达。模式识别受体主要包括:DNA识别受体、Toll样受体、RIG-I受体等。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（c GAS）是胞浆内的DNA识别受体,在识别病原体或肿瘤DNA后,可合成环二核苷酸（c GAMP）,激活干扰素基因刺激蛋白（STING）,诱导合成I型干扰素和干扰素刺激基因,清除病原体或肿瘤细胞。有研究表明,HBV逃逸c GASSTING信号通路的识别,可能是导致感染慢性化的重要原因,但在HBV治疗领域,针对STING信号通路进行的研究甚少。开展慢性HBV感染者中STING信号通路的相关研究、探索STING激动剂是否能有效抑制HBV及其中的免疫学机制,对于寻找乙肝治疗的新靶点具有重要意义。材料与方法:本研究收集不同免疫分期HBV感染者的外周血及肝脏组织样本,其中,外周血样本来自2019年3月至12月间,就诊于吉林大学第一医院的59名慢性HBV感染者和13名健康志愿者,经外周血分离出血浆和外周血单个核细胞用于后续实验;肝脏病理切片标本来自吉林大学病理学组织标本库,包括19名慢性HBV感染者的肝脏穿刺标本和6名肝脏血管瘤手术患者的瘤旁正常组织标本。我们先后测定了患者的肝功能及外周血中的HBV病原学相关指标,并应用Luminex技术检测了IFN-γ、TNF-α、IP-10等细胞因子的表达;在外周血单核细胞中,应用q RT-PCR的方法检测STING、IFN-β、MX-1及其他模式识别受体的m RNA表达;对于组织标本,应用免疫组化染色的方法,对肝组织中STING的表达及巨噬细胞的极化类型进行检测。通过细胞学实验,本课题评价了STING激动剂对巨噬细胞免疫功能的影响。将人单核细胞白血病（Human monocyte leukemia cell line,THP-1）细胞诱导分化为巨噬细胞,并给予不同浓度的STING激动剂进行刺激,利用酶联免疫吸附测定的方法,检测上清液中IFN-β、IL-6等细胞因子的表达。对1例未经治疗的HBV感染者手术切除的肝组织进行体外灌流,分离携带有HBV病毒的人原代肝细胞及肝内巨噬细胞进行体外培养,并评价STING激动剂在人类原代细胞中的抗HBV疗效。在动物实验中,采取尾静脉注射r AAV8-1.3HBV病毒的方法构建慢性HBV感染的小鼠模型,在注射病毒后规律监测HBV感染标志物的变化,确认模型构建成功。给药期间,监测小鼠体重变化及转氨酶水平,利用ELISA及流式微球检测法（CBA）检测外周血中IFN-β及炎症细胞因子的表达,利用q PCR及电化学发光发检测外周血中HBV DNA、HBs Ag和HBe Ag的变化。收集小鼠肝组织,对肝内干扰素及致炎因子基因表达、肝内HBV DNA进行检测,另取肝组织进行病理学相关分析,冻存部分新鲜肝组织用于后续转录组测序;测量小鼠脾脏长度及重量,计算脾脏指数,并对脾脏淋巴细胞分型进行流式相关检测。进一步,在HBV感染的小鼠模型中,对STING激动剂发挥抗病毒作用的免疫学机制进行了探索。通过氯膦酸盐脂质体、体内T淋巴细胞和干扰素-α受体的抗体,对巨噬细胞、T淋巴细胞进行体内剔除,对干扰素信号通路进行封闭,以此评估不同免疫细胞和干扰素信号通路对于STING激动剂抑制HBV复制的影响。利用转录组测序技术检测STING激动剂作用后,小鼠肝组织m RNA表达水平的变化,寻找到有意义的差异表达基因,并通过功能富集分析,明确差异表达基因所富集的信号通路。研究结果:根据患者外周血中HBV病毒学指标、转氨酶水平,将未接受过抗病毒治疗的HBV感染者划分为免疫耐受期、免疫激活期、非活动低水平复制期和恩替卡韦治疗后人群,并设置健康人群作为对照。对外周血单个核细胞（PBMC）中模式识别受体基因的表达进行分析,结果显示,与免疫耐受期相比,免疫激活期的PBMC中的STING、Toll like receptor 8基因在免疫激活期的表达有明显升高（P＜0.05）。IP-10和TNF-α等细胞因子在免疫激活期也有明显升高（P＜0.05）,提示该阶段存在免疫系统的活化。在慢性HBV感染者的肝组织中,检测到STING在免疫活动期的表达量较非活动期和健康对照组都有升高（P＜0.05）,而免疫耐受期的患者和正常人间无显著差异。对肝组织中巨噬细胞极化类型的检测显示,非炎症活动期慢性HBV感染者肝内M2型巨噬细胞的表达较炎症活动期患者明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。在体外实验中,将THP-1细胞诱导为巨噬细胞,经STING激动剂刺激后,可在培养基上清液中检测到IFN-β、IL-6的水平明显升高,并且与STING激动剂的浓度具有剂量相关性。进一步,在HBV感染者的原代肝细胞和肝内巨噬细胞的体外培养模型中发现,肝内巨噬细胞的参与能够增强STING激动剂对肝细胞中HBV复制的抑制。在动物实验中,检测到STING激动剂可激活HBV感染小鼠体内的免疫应答。STING激动剂处理组小鼠的外周血IFN-β和IL-6水平升高、肝内干扰素和致炎因子基因表达上调、脾脏指数及脾脏体积的增加,与对照组相比,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。进一步对STING激动剂的抗HBV功效进行评价,STING激动剂可使HBV感染小鼠的外周血HBV DNA、HBs Ag和HBe Ag的水平下降,其中以HBV DNA下降最为明显,且与STING激动剂的剂量存在相关性;在肝组织中,同样可检测到STING激动剂处理组HBs Ag及肝内HBV DNA水平的下降。对STING激动剂与恩替卡韦联合用药的效果进行评价,与STING激动剂单药相比,联合用药组HBV DNA下降更为明显。在对免疫机制的探索中,我们在免疫细胞缺陷的模型中评价了STING激动剂的抗HBV疗效,结果显示,巨噬细胞和T淋巴细胞剔除都会抑制STING激动剂发挥的抗HBV效应,但从抑制程度上来看,巨噬细胞对于STING激动剂发挥抗HBV效应的影响更为关键。在阻断干扰素受体后,大部分经STING激动剂诱导上调表达的干扰素及致炎因子基因都会被抑制,对HBV复制的抑制作用减弱,确认了干扰素信号通路在介导STING激动剂免疫活动中的关键作用。对STING激动剂治疗组和对照组的肝组织转录组学数据进行分析,共筛选出856个差异表达基因,其中上调基因665个,下调基因191个。经过GO分析,差异表达基因在生物进程中主要富集到了信号转导、细胞转化等过程,在细胞成分方面富集在细胞间连接、大分子复合物等细胞组成成分,在分子功能上主要富集在结合、催化活性等功能上;行GO富集分析显示,差异表达基因在趋化因子受体活性、2’5’寡聚腺苷酸合成酶（OAS）的活化、单核细胞趋化以及抗原呈递等功能上均有富集。进一步行KEGG通路富集分析显示,差异表达基因在吞噬、细胞外基质受体识别、细胞间粘附、抗原呈递等与免疫相关的信号通路上有显著富集。研究结论:STING信号通路作为DNA识别受体,在固有免疫应答系统识别病原体DNA的过程中扮演重要角色。本课题揭示了STING的表达与HBV感染者不同免疫阶段的炎症水平具有相关性,检测了慢性HBV感染者肝内巨噬细胞的极化状态,并初步评价了STING激动剂在人类HBV感染原代肝细胞中发挥的抗HBV疗效,为探索STING信号通路在慢性HBV感染进程中的临床意义提供了来自人类样本的证据。利用r AAV8/1.3HBV慢性HBV感染小鼠模型,检测到STING激动剂能够有效诱导机体免疫应答,发挥抗HBV作用,这一过程中,巨噬细胞及T淋巴细胞都介导了STING激动剂发挥的抗病毒应答,伴随有肝内多个免疫相关基因表达的上调和免疫通路的活化。该研究为STING激动剂未来在HBV治疗领域的研发及临床应用提供了更多的理论依据。