论文部分内容阅读
目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种在老年人群中比较常见的痴呆。发病较隐匿,一旦患病就会严重影响日常生活。其发病机制较为复杂,目前尚未完全明确。近年来,越来越多的研究集中在血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性及血管病变机制。研究表明,AD患者血脑屏障通透性是增加的,血管病变存在于AD的发生及疾病进展的每一个阶段,很多血管的变化早于AD的病理生理改变和临床表现。但是AD患者或者动物模型或者细胞模型的血脑屏障改变机制不完全明了,微血管密度改变的具体变化和机制也不明确。MicroRNAs(miRNAs)是一种类长度约22-24个核苷酸的内源性单链非编码的微小RNA,参与细胞的发育、分化、增殖和凋亡等过程,并发挥着重要的作用。miR-424-5p是miR-15/107家族的成员,miR-15/107与人类肿瘤、心血管疾病、神经系统变性疾病包括阿尔茨海默病相关。研究表明miR-424-5p能够促进体外血管生成,并且在缺氧的血管内皮细胞中表达上调,而它在AD中的作用目前尚未见报道。Endophilin-1是一种多功能蛋白,主要分布于中枢神经系统的细胞膜和细胞质中,其功能为调节细胞内吞和细胞内信号转导通路。前期试验已经验证Endophilin-1能够通过EGFR-ERK1/2和EGFR-JNK通路调节紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin的表达,影响血脑屏障通透性。并且建立了人Endophilin-1基因的重组真核表达质粒,通过转染人脑微血管内皮细胞,得出结论,Endophilin-1基因过表达抑制其体外血管生成。在本研究中,我们首先用Aβ1-42孵育人脑微血管内皮细胞模拟阿尔茨海默病环境,验证miR-424-5p在Aβ1-42孵育的hCMEC/D3细胞中的表达；其次在Aβ1-42孵育的大环境下瞬时转染miR-424-5p过表达和表达沉默质粒,建立阿尔茨海默病BBB模型,研究miR-424-5p对阿尔茨海默病BBB通透性以及体外血管生成的影响；然后稳定转染Endophilin-1过表达和表达沉默质粒,研究Endophilin-1对体外血管生成的影响；最后双向验证miR-424-5p和Endophilin-1共同调控阿尔茨海默病BBB的通透性和血管生成。本研究旨在初步明确miR-424-5p调控AD血脑屏障通透性和血管生成的效果及其可能的分子机制,为AD的治疗提供新的策略。方法:1、人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3细胞,Aβ1-42孵育的hCMEC/D3细胞以及人胚肾细胞系HEK93T细胞的培养。2、miR-424-5p过表达和表达沉默瞬时转染细胞系及相应的体外BBB模型的建立。3、Endophilin-1过表达和表达沉默稳定转染细胞系的建立。4、miR-424-5p和Endophilin-1共转染及相应的体外BBB模型的建立。5、应用实时荧光定量PCR检测miR-424-5p在正常脑微血管内皮细胞和Aβ1-42孵育的微血管内皮细胞中的内源性表达水平。6、应用跨内皮电阻(transendothelial electric resistance,TEER)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)渗出量来检测体外BBB模型的通透性变化。7、应用Western blot和免疫荧光发检测内皮细胞中Endophilin-1、紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的蛋白表达水平变化。8、应用双荧光素酶报告基因分析miR-424-5p和Endophilin-1存在结合位点。9、应用CCK-8法检测内皮细胞的增殖能力变化。10、应用Transwell迁移实验检测内皮细胞的迁移能力变化。11、应用小管形成实验检测内皮细胞的血管生成能力变化。结果:1、成功建立miR-424-5p过表达或表达沉默的瞬时转染细胞系以及相应的体外BBB模型。2、成功建立Endophilin-1过表达或表达沉默的稳定转染细胞系。3、miR-424-5p在Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞中的表达较正常脑微血管内皮细胞(endothelial cell,Ecs)显著升高。4、miR-424-5p过表达显著增加BBB通透性,miR-424-5p表达沉默显著降低BBB通透性。5、miR-424-5p过表达显著下调紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的蛋白表达水平,miR-424-5p表达沉默显著上调ZO-1和occludin的蛋白表达水平。6、Endophilin-1与miR-424-5p存在结合位点。7、miR-424-5p过表达显著上调Endophilin-1的蛋白表达水平，miR-424-5p表达沉默显著下调Endophilin-1的蛋白表达水平。8、miR-424-5p和Endophilin-1共同调节BBB的通透性。9、miR-424-5p和Endophilin-1共同调节紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的蛋白表达水平。10、miR-424-5p过表达抑制Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞增殖,miR-424-5p表达沉默促进其增殖。11、miR-424-5p过表达抑制Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞的迁移,miR-424-5p表达沉默促进其迁移。12、miR-424-5p过表达抑制Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞的血管生成,miR-424-5p表达沉默促进其血管生成。13、Endophilin-1过表达抑制Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞增殖,Endophilin-1表达沉默促进其增殖。14、Endophilin-1过表达抑制Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞的迁移,Endophilin-1表达沉默促进其迁移。15、Endophilin-1过表达抑制Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞的血管生成,Endophilin-1表达沉默促进其血管生成。16、miR-424-5p和Endophilin-1共同影响Aβ1-42孵育的脑微血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。结论:1、miR-424-5p在Aβ1-42孵育的内皮细胞中表达增多。2、miR-424-5p通过调节Endophilin-1,影响影响紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达,进而调节Aβ1-42孵育的体外BBB模型的通透性。3、在Aβ1-42孵育的内皮细胞中，Endophilin-1能够调节内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。4、miR-424-5p通过调节Endophilin-1影响Aβ1-42孵育下内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。