【摘 要】
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【目的】急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）发病率高,并且增加慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和终末期肾脏病发病风险,造成巨大社会负担。如何防止急性肾损伤向慢性肾脏病转化是亟需解决的问题。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain[NOD]-like recepto
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81770666、81570604、81370794）; 上海市卫计委中西医结合重点专项（ZHYY-ZXYJHZX-1-02）; 上海市中西医临床协作试点建设项目（ZY（2018-2020）-FWTX-1001）); 国家科技支撑计划（2015BAI12B06、2013BAI09B05）; 国家卫计委公益性行业科研专项（2015SQ00124）
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【目的】急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）发病率高,并且增加慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和终末期肾脏病发病风险,造成巨大社会负担。如何防止急性肾损伤向慢性肾脏病转化是亟需解决的问题。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain[NOD]-like receptor protein 3,NLRP3）炎症体是先天免疫系统的重要组分,在急性肾损伤和慢性肾脏病中均发挥重要作用,但其是否参与AKI向CKD转化仍然是未知的。本研究拟探讨:1.AKI向CKD转化过程中NLRP3炎症体的作用;2.NLRP3炎症体是否通过调控线粒体损伤和线粒体自噬影响AKI向CKD转化。【方法】实验分组:建立顺铂低剂量多次给药诱导的急性肾脏病（cisplatin-induced acute kidney disease,CP-AKD）模型,模拟AKI向CKD转化的进程。本课题采用了野生型和NLRP3基因敲除小鼠,每种小鼠分为以下两组:（1）对照组:连续于第0d、7d、21d腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS）,共三次,剂量为7.5mg/kg/次,于第28天处死。（2）CP-AKD组（腹腔注射顺铂）:连续于第0d、7d、21d腹腔注射顺铂,剂量为7.5mg/kg体重,于第28天处死。NLRP3炎症体特异性阻断剂MCC950干预实验,野生型小鼠分为以下三组:（1）对照组:连续于第0d、7d、21d腹腔注射PBS,剂量为7.5mg/kg/次,于第28天处死。（2）CP-AKD组:连续于第0d、7d、21d腹腔注射顺铂,剂量为7.5mg/kg/次。第21天腹腔注射顺铂后,每日腹腔注射PBS 20mg/kg。于第28天处死。（3）MCC950干预组:连续于第0d、7d、21d腹腔注射顺铂,共三次,剂量为7.5mg/kg/次。第21天腹腔注射顺铂后,每日腹腔注射MCC950 20mg/kg。于第28天处死。为评估该模型中小鼠肾脏纤维化和NLRP3炎症体的活化,小鼠于第1次顺铂注射后7d、14d、21d、28d处死。后续所有组别小鼠于第28d处死,于处死当时采集小鼠血清和肾脏组织。小鼠血肌酐尿素氮采用全自动生化分析仪检测。H＆E染色、PAS染色、Masson染色、Sirius Red染色评估小鼠肾组织病理改变;Western Blotting法检测小鼠肾组织中NLRP3炎症体相关蛋白和线粒体自噬相关蛋白及caspase-3表达变化;q-PCR检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TGFβ1、COL1A1、COL3A1、BNIP3、ATG5、ATG6、ATG7 m RNA表达;免疫组化检测TGFβ1、Collagen III、vimentin、FSP-1表达;免疫荧光染色检测E-cadherin、α-SMA、IL-1β表达和定位;电镜检测小鼠肾小管上皮细胞线粒体损伤;DHE染色和SOD、MDA检测评估肾组织氧化应激反应。【结果】1.顺铂低剂量多次给药引起小鼠肾脏发生AKI向CKD转化。顺铂低剂量多次给药造成小鼠肾小管刷状缘脱落、管腔扩张、肾小管上皮细胞萎缩、小管间质纤维化改变,伴有肾小管上皮细胞失分化、向间质转化。同时小鼠血肌酐、尿素氮水平呈进行性升高。2.顺铂低剂量多次给药引起小鼠肾脏NLRP3炎症体活化。CP-AKD小鼠肾组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白和RNA表达上调,同时caspase-1和IL-1β剪切增加。IL-1β表达增多主要定位在肾小管上皮细胞。3.抑制NLRP3炎症体活化可减缓AKI向CKD转化。多次顺铂注射后,与野生型小鼠相比,NLRP3-/-小鼠肾组织小管间质胶原沉积明显减少、糖原沉积减少,collagen I、collagen III表达减少;TGFβ1表达减少,Smad2/3磷酸化水平降低,炎症因子表达减少。炎症体特异性抑制剂MCC950可明显减轻顺铂多次注射所致肾功能下降和肾脏结构损伤,减轻肾小管间质胶原沉积,抑制α-SMA、collagen I、collagen III表达。4.顺铂低剂量多次给药引起肾小管上皮细胞发生线粒体损伤,线粒体自噬激活。顺铂低剂量多次给药引起小鼠肾组织氧化应激增加、肾小管上皮细胞线粒体形态改变、细胞色素c向胞浆释放增多,线粒体动力学相关蛋白表达改变;PINK1/Parkin、BNIP3介导的线粒体自噬激活。5.抑制NLRP3炎症体增强顺铂诱导的线粒体自噬,减轻线粒体损伤。NLRP3基因敲除或应用炎症体特异性抑制剂MCC950,可增强PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,减少细胞内氧化应激反应,抑制细胞色素c的释放,保护线粒体形态。【结论】1.顺铂低剂量多次给药诱导小鼠急性肾脏病表现,模拟了AKI向CKD转化的过程。2.NLRP3炎症体活化促进了顺铂诱导的AKI向CKD转化。3.抑制NLRP3炎症体活化减轻顺铂诱导的小鼠肾小管间质纤维化和肾小管上皮细胞间质转化。4.抑制NLRP3炎症体通过增强线粒体自噬减轻顺铂诱导的线粒体损伤。
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