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本研究从广东省开平虫草生产基地受污染的虫草培养基上分离纯化得到一株真菌,经鉴定为黄蓝状菌(Talaromyces flavus)。有关黄蓝状菌的文献报道并不是太多,有关报道主要集中于其对于高等植物黄萎病的抑制作用,至今并无该菌化感作用及其天然产物分离鉴定方面的研究报道。本研究通过生物测定实验方法,证明了其次生代谢产物对杂草和病原菌有化感作用,并且对其液体发酵培养基做了优化,然后对其发酵产物进行了初步分离鉴定。
黄蓝状菌具有明显的除草活性,在固体培养基条件下,黄蓝状菌对稗草根的抑制率达到29.4%,对稗草苗的抑制率达到54.6%;对油菜根的抑制率达到64.4%,对苗的抑制率达到35.3%。而其发酵液8倍稀释液对稗草的根长抑制率达到100%,对苗高的抑制率为69.2%;对油菜根的抑制率为91.1%,对苗高抑制率为100%。
黄蓝状菌也表现出对香蕉枯萎病菌的抑制活性,其活体对香蕉枯萎病菌的抑菌圈直径达到12.6mm。其发酵液也对香蕉枯萎病菌产生了明显的抑制效果,在正常PDA生长三天的香蕉枯萎病菌落直径为3.70 mm,而混合有发酵液的PDA上生长的香蕉枯萎病菌落直径仅为1.60 mm。
用溶媒萃取法对黄蓝状菌化感活性物质的极性进行研究,通过生物活性比较,结果表明大部分化感物质能被乙酸乙酯提取,为中等极性物质。
为了更多更有效地获得黄蓝状菌的次生代谢产物,本实验对其液体发酵曲线进行了研究,通过菌丝体干重法和分光光度计法测定了黄蓝状菌生长曲线,发现黄蓝状菌的发酵在0-24h时迅速进入对数期,其延迟期几乎可以忽略不计,在24-108h这段时间内为稳定期,尤其60-72h的时候,其发酵产物最为丰富,108h之后进入衰亡期。
同时对其发酵培养基进行了筛选,通过除草活性比较,分别选择了马铃薯和硫酸铵作为黄蓝状菌发酵培养基的有机氮源和无机氮源;选择了氯化钠、硫酸亚铁和磷酸二氢钾为发酵用无机盐。
在确定了发酵培养基的配方后,通过正交设计的方法对发酵培养基各组分进行了优化,以寻求其最佳的配比,通过对极差值R的比较,发现各因素对发酵的影响为:马铃薯>葡萄糖>KH2P04>(NH4)2S04>MgS04·7H2O>CaCO3>NaC1,从而确定其各组分的配比为马铃薯30%,葡萄糖1%,KH2P040.75%,(NH4)2SO40.5%,MgSO4·7H2O0.025%,C8CO30.2%,NaC10.25%。
通过有机溶剂浸泡提取和溶剂萃取对发酵产物进行次生代谢产物的提取,中等极性部分用气相色谱/质谱联用仪进行分析,得到可计算的成分有27个,通过标准谱库的质谱数据进行检索共鉴定了15个化合物。其中的主要成分为对羟基苯乙醇、对羟基苯乙酸甲酯、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸甲酯、对羟基苯丙酸。
通过各种柱层析手段和波谱技术从该菌次生代谢产物中分离鉴定得到4个化合物,分别鉴定为:邻苯二甲酸正二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯、十八碳-顺-9-烯酸和一个麦角甾酮的衍生物。