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金龙胆草(Conyza blinii H.Lev)为一种分布于川西南、滇北地区的菊科白酒草属植物,是20世纪70年代四川省发掘的民间草药,具有清热解毒、消炎祛痰、止咳平喘的功效。其全草含有黄酮、皂苷、苦蒿素等药用成分,其中苦蒿素仅存于金龙胆草中,是它的特征化合物并可作为专属性指标控制该药材的质量,由于苦蒿素在植株中的含量偏低,使该药材不能满足生产药物制剂需求。提高苦蒿素含量是改善金龙胆草药材质量的关键。研究其合成途径是提高苦蒿素含量的基础。本研究采用同源克隆和RACE技术,获得苦蒿素合成分支途径的关键酶基因；利用半定量RT-PCR和HPLC技术,调查金龙胆草苗期和花期1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因表达量与苦蒿素含量的时空性,分析其对苦蒿素含量的影响。主要研究结果如下：1、利用同源克隆和RACE技术,获得了金龙胆草的管家基因——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因,其全长cDNA为1020bp编码340个氨基酸,命名为CbGAPDH, GenBank登录号为：KF027475。该基因与其它植物GAPDH基因相似性均为93%以上。半定量RT-PCR,结果表明CbGAPDH在各部位表达稳定,可作为内参使用。2、获得金龙胆草苦蒿素途径的第一个关键酶——1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因。该基因全长cDNA为2479 bp,包含一个2190bp的完整开放阅读框(ORF),命名为CbDXS,基因登录号为：KJ155788,编码730个氨基酸,信号肽预测表明其含有一个18aa的信号肽序列和一个712aa的成熟蛋白。与GenBank数据库进行序列比对发现该基因具有TPP结合的结构域,属于植物Ⅱ类DXS基因。通过半定量RT-PCR技术对苗期和花期CbDXS的表达量进行相对定量分析。结果显示,苗期CbDXS在金龙胆草叶茎根中的相对表达量分别为72.67%、17.67%和28.00%,花期CbDXS在花和根中不表达,在叶和茎中的表达量分别为：59.27%和34.37%。高效液相色谱技术对苗期和花期各部位的苦蒿素含量进行测定,结果显示,苗期和花期苦蒿素含量最高的组织均为叶片,其中苗期新鲜叶中苦蒿素含量为0.961%,而茎与根中含量相接近,分别为0.228%和0.262%。花期叶中苦蒿素含量达到1.534%,茎中苦蒿素含量为0.378%,比苗期提高了1.5倍左右,而根中为0.309%,花中苦蒿素含量为0.568%比茎和根中含量都要高。经相关性分析得出：金龙胆草苗期和花期叶片中叶中CbDXS表达量与苦蒿素含量呈正相关；茎中CbDXS基因的表达量与苦蒿素含量相关性最显著；而花与根中CbDXS的表达与苦蒿素的积累相关性小或不相关。3、克隆得到了一个cDNA全长1342bp的牻牛儿基铭牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)基因,包含一个1086bp的完整开放阅读框,编码362个氨基酸,具有GGPPS家族的富含天冬氨酸的保守序列,命名为CbGGPPS,基因登录号为：KJ652907。以CbGAPDH作为内参对该基因在不同时期不同部位的表达量进行了相对定量分析。结果表明CbGGPPS基因在苗期金龙胆草叶茎根中的表达量分别为：70.80%、66.03%和17.50%；花期,CbGGPPS基因在各部位都有表达,差具有明显差异性,花中为3.37%,叶中为60.13%,茎中为15.20%,根中表达量最小为2.50%。相关性分析发现,不同于CbDXS, CbGGPPS除了花在其余部位的表达量与苦蒿素含量的相关性都较为显著；CbGGPPS和CbDXS两者的表达量相关性显著。另外,以克隆获得的CbGGPPS基因为基础,利用大肠杆菌表达载体pET-30b(+)构建CbGGPPS原核表达载体pET-30b(+)-CbGGPPS,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。SDS-PAGE分析表明,该酶分子量为40kDa左右,与预测值符合,初步证明成功获得了该酶基因。