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决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子,富含蒽醌类、萘骈.吡咯酮类、脂肪酸类、氨基酸和微量元素。作为临床常用中药,它能用于治疗眼病、便秘、高血压、高胆固醇血症、发热和炎症等疾病,其抗氧化和降脂功能尤为突出。
本论文以决明子为研究对象,运用现代分离和分析检测技术并结合多种药物筛选模型,分析其抗氧化和降脂活性成分,建立相关的高速逆流色谱(HSCCC)分离及GC-MS、HPLC和LC-MS等分析条件,并对分离得到的单体进行功能评价,探讨其抗氧化和降脂活性的机制,同时研究建立了高效的HSCCC-LC-PDA-MS联机在线分离检测生物活性成分的新技术。
主要的研究内容和结果如下:
1.决明子挥发油的萃取及其主要成分的GC-MS分析了水蒸汽蒸馏和超临界CO<,2>萃取工艺条件,利用GC-MS分析了两种萃取方法所得到的决明子挥发油的组成。结果表明,水蒸汽蒸馏得到的挥发油含有55个主要成分,得率为82.45%,其中含量最多的5个成分分别是油酸(23.63%)、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(20.56%)、n-十六烷酸(15.51%)、(E)-9-十八碳烯酸(6.50%)和硬脂酸(5.69%),总相对含量为65.39%。超临界C02萃取得到的挥发油主要含有74个成分,得率为92.69%,其中含量最多的6个成分分别是(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(26.74%)、油酸(24.15%)、n-十六烷酸(13.99%)、大黄酚(7.26%)、(E)-9-十八碳烯酸(4.52%)N硬脂酸(4.44%),总相对含量为81.10%。并发现决明子挥发油具有一定的抗氧化活性。
2. 利用药物功能筛选模型评价决明子提取物的活性利用抗氧化模型和酵母双杂交降脂模型对决明子的挥发油(超临界流体萃取部分)和溶剂萃取物(二、三、四部份)进行功能评价和筛选,确定了各部分活性的强弱。四个部份的抗氧化活性顺序从大到小依次为:第二部分(清除DPPH自由基IC<,50>=34.5μg/Ml,清除·OH自由基IC<,50>=52.6μg/Ml)、挥发油(清除DPPH自由基IC<,50>=137μg/Ml,清除.OH自由基IC<,50>=67μg/Ml)、第三部分(清除DPPH自由基IC<,50>=288μg/Ml,清除·OH自由基IC<,50>=374.5μg/Ml)和第四部分(清除DPPH自由基IC<,50>=624μg/Ml,清除.OH自由基IC<,50>=504μg/Ml)。降脂活性顺序从大小依次为:第二部分(B.半乳糖苷酶活力提高率=84.49%/200μg)、第三部分(β-半乳糖苷酶活力提高率=55.69%/200gg)和第四部分(β-半乳糖苷酶活力提高率=37.76%/200μg)。结果表明,决明子挥发油具有一定的抗氧化活性,其中可能具有抗氧化功能的3种成分分别是(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(26.74%)、大黄酚(7.26%)和2,6-二叔丁基对甲酚(0.09)。高抗氧化活性和高降脂活性的活性组分均为第二部分萃取物,并探讨了它们的抗氧化活性机理。
3.应用高速逆流色谱技术分离制备活性单体化合物通过分离条件的,利用高速逆流色谱一次性分离了第二部分萃取物中的多个活性成分,分离得到5个单体化合物(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ),其含量分别为19.25%、8.73%、6.47%、24.52%和7.59%。从500mg粗提物中分离制备了单体Ⅲ(90.42mg)、Ⅳ(45.39mg)、Ⅴ(31.84 mg)、Ⅵ(121.71 mg)和Ⅶ(39.10mg)。利用HPLC分析了上述单体的纯度分别为97.4%、93.0%、94.8%、96.3%和 95.5%,回收率分别为91.5%、96.7%、93.3%、95.6和98.4%。
4.研究建立高效的HSCCC-LC-PDA-MS联机在线分离检测新技术在高速逆流色谱分离活性组分的基础上,研究建立了新型高效的HSCCC-LC-PDA-MS联机在线分离检测技术,实现了决明子粗提物中5个高纯度单体化合物的同时分离、纯度的在线检测和分子量测定。该项联用新技术明显提高了HSCCC分离产物的检测灵敏度和效率,也为拓展HSCCC在天然产物分离领域的应用范围提供了一种通用模式。
5.五个单体化合物的抗氧化与降脂活性评价及其结构鉴定利用抗氧化和降脂模型对上述5个化合物进行功能评价。结果表明,其清除DPPH自由基的活性由高到低的顺序依次为:抗坏血酸(AA)>Ⅵ>Ⅳ>BHT>Ⅲ>Ⅴ>Ⅵ清除OH.活性的顺序为:AA>Ⅳ>Ⅶ>Ⅲ>Ⅴ>Ⅵ;清除O<,2><->·活性的顺序为:AA>Ⅶ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅴ>Ⅵ:降脂活性的顺序为:Ⅶ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅴ>Ⅵ,从而确定决明子中具有抗氧化和降脂活性的单体化合物为Ⅳ(清除DPPH自由基IC<,50>=21.4μg/Ml,清除OH·自由基IC<,50>=41.6μg/Ml,清除O<,2><->·咱由基IC<,50>=22.8μg/Ml,β-半乳糖苷酶活力提高率为84.04%/200μg)和Ⅶ(清除DPPH自由基IC<,50>=17.8μg/Ml,清除OH·自由基Icso=55.4μg/Ml,清除O<,2><->·自由基IC<,50>=17.1μg/Ml,β-半乳糖苷酶活力提高率为94.38%/200μg)。用LC-MS测得单体Ⅳ、Ⅶ的分子量分别为358和270;用NMR波谱技术解析了它们的结构,证实Ⅳ为1,3,8-三羟基-6,7-二甲氧基-2-甲乙醚基葸醌(1,3,8-trihydroxy-6,7-dimethyl-2-ethyl methyl ether anthraquinone),Ⅶ为大黄素(edomin)。其中Ⅳ在决明子中尚未见报道。