研究背景与目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎症导致软骨侵蚀破坏为病理中心的系统性自身免疫性疾病,临床主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎,并可累及多个脏器。关节滑膜的慢性炎症、增生,形成血管翳,侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等,造成关节软骨和骨的破坏,最终导致关节畸形和功能丧失。RA的发病率在我国约为0.4%,全球为0.5%-1.0%[1],多发于中青年,该病致残率很高,严重影响患者的工作和生存质量。但是RA的病因与发病机制至今尚未完全清楚。RA动物模型是研究RA病因和发病机制的最为有效的途径之一。传统的RA动物模型包括两大类,一是诱导性关节炎如佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, A A)、胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)等,一是自发性关节炎主要是指基因修饰关节炎小鼠,包括K/BXN小鼠、NZB/NZW小鼠[2]。这些RA动物模型虽可模拟出外周多关节的炎症反应,表现出关节的红肿、疼痛,病理变化也可表现出关节软骨破坏、骨侵蚀,关节腔内有炎症细胞浸润等特点,与人RA在临床表现、病理、免疫有着相似或相近的特点。但是关节炎症反应随着注射点的不同炎症局限,具有自限性,而且在血清中很难检测到RF、CCP抗体、炎症因子、基质金属蛋白酶等RA血清学指标。自发性动物模型除上述外周关节炎症表现外,虽可在血清中检测出RF、CCP抗体、MMP3等指标,但是造价昂贵,临床应用受限。由于RA病因病机复杂且多变,这些模型只是侧重于RA炎症反应这一特点,仅仅反映出是由T、B细胞介导的炎症反应这一过程,并没有完全反应慢性持续性炎症反应、滑膜炎症并增生、关节侵蚀破坏等中心病理特征,因此这些具有一定的局限性,制约了对RA病因病机的研究。随着对RA滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblast, RASF)的深入研究,发现RASF在RA的发病中不在作为一个“旁观者”,而是一个“主动参与者”[3]。在RA中,RASF一直处于慢性活化状态,细胞本身出现一系列转化特性,生长调控机制障碍,导致细胞出现“类肿瘤样生长”,自身过度增殖,且不依赖于“T细胞介导”这一途径就可分泌多种趋化因子、炎症因子、MMP类、组织蛋白酶类,引起慢性持续性关节炎、关节软骨侵蚀破坏,在RA滑膜增生,关节炎症,软骨的侵蚀破坏方面起着关键作用。上世纪90年代开始,Geiler[4]首次将人RA滑膜组织与人正常软骨联合移植入SCID小鼠的肾囊中,发现移植的滑膜出现增生,并侵蚀人的软骨,在侵蚀处检测到滑膜成纤维样细胞增生活跃,大量表达基质降解酶的mRNA。成功建立一种新型的人源化动物模型—SCID—HuRAg鼠嵌合体模型。随后造模方式、移植材料得到不断的改进。移植物可以是滑膜组织,体外培养的滑膜细胞,也可以是关节液；移植方式可以是滑膜和软骨共同移植,滑膜细胞和软骨共同移植,也可以是单独的滑膜细胞为移植物；移植部位多样,可以是肾囊、腹腔、皮下、膝关节等[5-7]。随着SCID—HuRAg鼠动物模型的建立和不断的改进,不仅证实RASF的关键作用,完善了RA的发病机制,而且在药理研究、新药开发方面发挥了不可替代的作用。由于SCID—HuRAg鼠嵌合体模型能完全不受T、B细胞的影响,在无免疫炎症的环境下,表现出的病变过程与人RA滑膜、软骨病变过程几乎一致,且可在血清中检测到CCP抗体、IL-6、TNF-a等因子,成为RA动物模型的主流。但是在国内,对人源化的SCID—HuRAg鼠动物模型的研究起步很晚,仅有报道将滑膜组织和人的正常软骨植入SCID鼠的耳廓或皮下[8、9],观察到滑膜组织的增生和对软骨的侵蚀破坏。而我国中药资源丰富,为了更有效的筛选有效的中草药,在吸取前人的经验基础上,我们将制作人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞—软骨—SCID鼠嵌合体模型,初步探讨RASF在SCID鼠体内的作用机制,填补国内的空白。研究方法(一)建立人RASF/OASF体外培养与鉴定1、采用两种酶类(Ⅱ型胶原酶和0.25%胰酶)联合消化的方法,消化、分离培养、传代、冻存人RASF/OASF,建立培养和保存体系。2、采用自然纯化法和反复贴壁法纯化滑膜成纤维细胞,用vimentin抗体和CD68抗体鉴定滑膜成纤维细胞。3、采用5—溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,5-Brdu)标记方法标记滑膜细胞。将浓度为10mmol/l的5-Brdu液经完全培养基稀释后加入细胞培养瓶中,细胞培养液定容至10ml,使5-Brdu的终浓度为10umol/1,放入培养箱中培养,用鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体鉴定细胞标记效果。(二)模型移植方法的建立1、移植细胞的选择选择第四代活力良好、经纯化的、做好5-Brdu标记的滑膜成纤维细胞经消化、离心、重悬,细胞密度调整为2×105,做为移植细胞。2、人正常软骨的选择软骨来源为一例因糖尿病坏疽行而行左踝关节截肢术的踝关节软骨,消毒、逐层分离皮肤、肌肉,暴露踝关节,剔除关节软骨,将关节软骨修剪成大小约0.5cm×0.5cm大小,在离体3h内植SCID鼠体内。3、无菌明胶海绵将无菌明胶海绵修饰成约0.8cm×0.8cm大小的小块,备用。4、模型制作将SCID鼠随机分为两组,RASF组和OASF组,麻醉、备皮、消毒,在小鼠背部脊正中线外右侧约1cm处做约1-1.5cm长的纵行切口,将修剪好的软骨小块处入皮下,放平。同样将修剪好的无菌明胶海绵置于软骨面上,将500ul细胞液注入放置好的明胶海绵内,使海绵充分湿润,缝合切口皮肤并消毒。RASF组注射细胞为RASF, OASF组注射细胞为OASF。(三)模型评价方法1、制作移植物石蜡H&E切片,观察评价滑膜成纤维细胞对移植物软骨的侵蚀降解程度,做出组织学评分,给予统计学处理。2、制作鼠双膝关节石蜡H&E切片,观察鼠膝关节滑膜增生情况和膝关节软骨侵蚀破坏程度,做出组织学评分,给予统计学处理。3、免疫组织化学法检测滑膜成纤维细胞5-Brdu抗体和vimentin抗体,观察滑膜成纤维细胞在SCID鼠体内活动情况。4、利用IL-6、MMP3酶联免疫吸附法试剂盒检测两组模型鼠血清中人IL-6、MMP3的含量。研究结果(一)滑膜成纤维细胞的培养、鉴定、标记通过酶消化法,获得大量的滑膜细胞,利用自然纯化发和反复贴壁法,在细胞传代培养至第三时,行细胞形态鉴定,滑膜成纤维细胞呈vimentin阳性,CD68阴性,在荧光显微镜下观察,滑膜成纤维细胞呈绿色荧光状,细胞形态多样,以纺锤形为主,细胞核呈卵圆形,位于细胞中央,核仁清楚。细胞呈涡状生长,活力良好。滑膜成纤维细胞的纯化率高。检测5-Brdu标记,在显微镜下观察,标记好5-Brdu的滑膜成纤维细胞细胞核出现棕黄色着色,细胞标记率高。(二)模型鼠评价结果1、移植物组织学评价镜下观察移植物内滑膜成纤维细胞在皮下和软骨周围存活并增生,侵蚀软骨,侵蚀点多在软骨边缘,软骨表面很少见到侵蚀点。软骨边缘的软骨细胞介导周围软骨降解明显,软骨细胞形态发生改变,表现为软骨细胞核周围的晕轮空泡扩大,边缘失去锐利且较毛糙不光整。RASF组移植物的软骨侵蚀程度(0.643±0.690vs0.333±0.500)和软骨降解程度(2.286±0.756vs1.667±1.000)较OASF组有增高趋势。。2、膝关节组织学评价镜下观察小鼠膝关节滑膜有不同程度的增生,在鼠膝关节腔里也可看到增生的滑膜,有新生血管形成,有些血管与增生的滑膜细胞形成纤维结节。增生的滑膜可侵蚀软骨,严重者可侵犯至骨质。RASF组鼠膝关节的滑膜增生程度(3.091±0.831vs1.667±0.985p<0.01)和软骨侵蚀程度(1.636±1.748vs0.583±1.379p<0.05)均显著高于OASF组。3、滑膜成纤维细胞在鼠体内活动途径免疫组化检测发现在SCID鼠皮下、移植软骨处、鼠膝关节滑膜及骨髓中检测出Brdu及vimentin阳性的SFs,证实滑膜成纤维细胞可经血液循环进行长距离迁移。4、血清学指标评价我们仅在RASFs组鼠血清中检测出一例人的IL-6，其含量为55pg/ml, OASFs组鼠血清未检测出IL-6。而MMP3的血清含量OA组为(39.50±17.35)pg/ml,在RASFs组仅有一只小鼠血清检测出MMP3,含量为59pg/ml。结论1、成功建立人RASF和OASF体外培养和保存体系；2、成功建立人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞—软骨—SCID鼠嵌合体模型,初步探讨滑膜成纤维细胞在SCID鼠体内的作用机制,即滑膜成纤维细胞在体内可分泌多种细胞因子,造成移植软骨降解,并可经血液循环,迁移至鼠膝关节腔,引起膝关节滑膜炎症,滑膜增生,关节软骨侵蚀破坏。RASF组的滑膜细胞在软骨侵蚀降解、鼠膝关节滑膜增生及侵蚀方面明显比OASF组程度严重,而OASF组中滑膜细胞在体内分泌的MMP-3较RASF组要高。