研究背景：心血管疾病是发达国家导致死亡的主要疾病,仅在美国就影响着8千余万人的身体健康。其中心肌梗死、心脏手术、体外循环结束后发生的心肌缺血-再灌注(I/R)损伤的程度对上述心血管疾病预后至关重要。心肌缺血-再灌注损伤的分子机制十分复杂,现有的临床预防与治疗方法的效果不甚理想。已有一些国内外学者对电针预处理技术应用于心脏保护进行了相关研究,并证实了电针预处理的可行性。电针疗法是由神经电刺激疗法与中医针灸疗法相结合而形成的,是指在中医毫针的基础上,在毫针上连接脉冲发生器,施加接近人体生物电的微电流刺激,使其在原来毫针刺激的基础上,对穴位施以不同波幅连续波、断续波等刺激,对机体实施持续、稳定、精确、可控的电刺激,并产生电生理效应。电针预处理作为有效的心肌保护方法,通过启动机体内源性保护机制,调动机体潜能,提高机体适应应激反应的能力。电针预处理操作便利,并可避免药物预处理的诸多不良反应,具有适应人群广的优势,有较为广阔的临床应用前景。相关的基础和临床研究已经证实,单独“内关”穴针灸治疗对心肌缺血有显著疗效。然而,针灸和电针的心脏保护的可靠机制尚未明确。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid, microRNA, miRNA)是一类内源性的小核苷酸片段,现已检测出700余种。大约30%的人类基因受miRNAs调节。miRNAs在众多心脏疾病的发生发展中也发挥着重要作用,诸如心肌肥大、心肌凋亡和血管生成等生理和病理进程。其中miRNA-214在不同的细胞中发挥着多种生物学作用,其可通过对多种靶基因的调控,在许多疾病中都发挥着重要的调节作用。研究证实,在心肌损伤时miRNA-214的表达增加,对于心脏功能的维持具有保护作用。心肌发生缺血-再灌注损伤时,心肌缺血-再灌注损伤机制中的细胞凋亡、PTEN机制以及HIF1AN等机制均可不同程度的被miRNA-214所有效抑制,从而有助于调动肌缺血-再灌注时的内源性心脏保护机制。在对预防和治疗治疗心肌缺血-再灌注损伤性疾病的靶向分子的相关研究中,有学者提出了miRNA-214有可能成为临床预防和治疗心肌缺血-再灌注损伤性疾病时的靶向分子的可能性。相关体内实验证实,电针预处理能够一定程度上减少心肌梗死面积、逆转心功能、降低血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的活性。现有的研究资料尚不能确定miRNAs在电针预处理对心肌缺血-再灌注损伤保护机制中的角色和作用。miRNA-214是许多心脏应激性疾病的敏感标志物,它在缺血-再灌注所致心脏损伤时表达上调,并可通过控制Ca+超载,乃至在缺血-再灌注时发挥保护作用。缺血-再灌注时心肌细胞损伤的重要原因之中包括心肌细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的超载。众所周知,在心肌缺血-再灌注损伤后,心肌细胞内会发生Ca2+超载,可导致钠/钙交换蛋白1 (NCX1)构型发生改变。随后,B淋巴细胞肿瘤因子2样蛋白11(BIM)、钙调素依赖性蛋白激酶118(CaMKⅡδ)、亲环素D(CypD)等Ca2+通道的下游效应器受构型发生变化的NCX1进一步激活,介导之后的心肌细胞死亡进程。同时,有关研究提出针灸治疗后的血清也可降低心肌细胞内的Ca2+含量,电针预处理有利于维持心肌细胞内Ca2+稳态。数项研究结果显示,对心肌细胞Ca2+稳态的维持同样也是电针预处理对于缺血-再灌注损伤发挥保护作用的重要机制之一。近期,有相关研究证实大鼠心脏缺血-再灌注时Ca2+超载所致的心肌细胞死亡进程能够在miRNA-214的作用下得到有效抑制。此外,笔者近期研究发现电针预处理对大鼠正常情况下H9c2细胞的Ca2+和NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等相关蛋白具有调节作用。为进一步揭示电针预处理的相关机制,此研究将研究重点放在了对心脏具有保护作用的miRNAs上。多项研究结果证实了一系列心脏应激反应中的敏感标志物中包括miRNA-214,在心脏肥大、心肌梗死和心脏衰竭时均发现有miRNA-214的表达上调。大鼠发生心肌缺血-再灌注时损伤时的内源性心脏保护机制中,miRNA-214表达上调的机制为学者所发现和证实。结合上述研究结果,此研究假设miRNA-214参与介导了电针预处理对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用,拟系统地检验电针预处理对在体和体外心肌缺血-再灌注损伤时的相关作用,以及电针预处理对心肌缺血-再灌注损伤发挥作用时是否有miRNA-214机制参与其中。第1章 电针预处理对在体和离体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用目的 评估电针预处理对在体和离体心肌细胞缺血-再灌注损伤时所发挥的相关作用。方法在体实验分组：雄性Sprague-Dawley大鼠24只随机分为四组(n=6)：假手术组(Sham组)、Sham+电针组(sham+EA)、缺血-再灌注组(I/R组)、缺血-再灌注+电针组(I/R+EA组)。在心肌缺血-再灌注损伤实验前3天,每天对Sham+EA组、I/R+EA组的大鼠实施双侧内关穴持续电针刺激30min。通过对I/R组及I/R+EA组大鼠冠状动脉左前降支(LAD)结扎并行缺血40min,再灌注180min来制备心肌缺血-再灌注模型。Sham组接受上述相同手术操作,但未行LAD结扎。离体实验分组：将H9c2细胞随机分为四组(n=3)：Control组、Control+电针组(Control+EA组)、氧糖剥夺组(OGD组)、氧糖剥夺+电针组(OGD+EA组)。Control+EA组和OGD+EA组细胞在OGD前10天,每天给予50Hz,0.5ms,17.3V,持续刺激30min。对OGD组和OGD+EA组细胞经氧-糖剥夺(OGD)制作心肌细胞缺血-再灌注模型。在体实验将各组SD大鼠实施3.5%水合氯醛(50ml/kg)腹腔注射麻醉,之后将大鼠取背位固定于实验台,行气管内插管及呼吸机通气。设定潮气量为20ml/kg,呼吸频率为50次/min。对大鼠四肢实施将大头针皮下穿刺后,将心电监护仪电极连接大头针以进行心电持续监护和记录。之后,取通过左胸第四肋间隙切口切开皮肤并暴露心脏,用套有聚乙烯小管的6-0丝线结扎冠状动脉左前降支(LAD),此时大鼠心电图呈现出宽大畸形的QRS波,将此时点记录为心肌缺血开始时间。在心肌缺血40min时,将行冠状动脉左前降支结扎的丝线拉松以实施心肌再灌注,180min后剪取大鼠心脏以备后续实验。Sham组大鼠接受上述相同手术,但未行LAD结扎与松解。离体实验将单层H9c2细胞置于25mmol/L高糖的达氏修正依氏培养基上,使用10%的牛胎儿血清进行细胞培养,培养气体为含5%CO2的37℃空气。每3天更换一次培养基。同时在含有5.5mmol/L葡萄糖的普通培养基中进行对照细胞培养,并将细胞暴露于24.5mmol/L甘露醇以进行培养基高渗状态评估。在H9c2细胞10天之后,使用无糖DMEM替代上述全部培养基,并通过将各组的H9c2细胞在37℃含5% CO2和95% N2(v/v)的气体中培养10小时来进行氧-糖剥夺处理细胞模型的制备。在缺氧处理结束后,使用新鲜高糖DMEM替换之前的各组培养基,并加入10%的牛胎儿血清,将细胞置于含5% CO2的37℃空气的常规培养箱内。在体电针预处理将两支不锈钢毫针刺入Sham+EA组和I/R+EA组大鼠“内关”穴,即尺、桡骨缝间,距腕关节约3mm处,约3mm深。两毫针连接电针治疗仪的正、负电极,在心肌缺血-再灌注损伤实验前3天,每天给予持续电针刺激30min。电针刺激频率为4/20Hz,脉冲密度为0.5ms,强度为1mA,以大鼠前爪轻颤为度。离体电针预处理将一副铂链置于3.5厘米培养皿中,对H9c2细胞实施微电流刺激,铂链两极连接到电刺激仪,刺激频率50Hz,脉冲密度0.5ms,连续10天,每天持续刺激30min。监测并比较Sham组、sham+EA组I/R组及I/R+EA组大鼠的心率(HR)、平均动脉压(MAP)、左室舒张末压(LVSP)、最大左室压上升/下降速率(±dp/dt)max等心功能指标,并测量心肌梗死面积。检测在体和离体实验的乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性,以及心肌细胞凋亡情况。结果再灌注180mmin时,Sham组、sham+EA组I/R组及I/R+EA组的HR、MAP、LVSP、±dp/dt max等心功能指标监测。统计结果表明,Sham组与sham+EA组大鼠的各项心功能指标差异无统计学意义。与sham组比较,I/R组大鼠的上述心功能指标均相对降低(P<0.05)。而电针预处理组能够有效缓解心功能损伤。I/R+EA组大鼠的各项心功能指标均较I/R组相对提高(P<0.05)。I/R+EA组大鼠的平均心肌梗死面积显著低于I/R组(P<0.05)。而I/R组大鼠血清LDH活性显著升高并高于I/R+EA组(P<0.01)。I/R组大鼠血清CK活性也显著升高且高于I/R+EA组(P<0.05)。OGD+EA组细胞上清液LDH活性低于OGD组(P<0.01),同时,OGD+EA组细胞上清液CK活性也低于OGD组(P<0.05)。OGD组细胞凋亡率为(7.2±1.5)%,而OGD+EA组细胞凋亡率下降至(4.6±0.5)%,P<0.05。结论体内和体外实验结果证实双侧内关穴电针与微电流预处理可有效保护心脏对抗心肌缺血-再灌注损伤。第2章miRNA-214介导了电针预处理对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用目的 评估电针预处理在体和离体心肌细胞的发挥心脏保护作用时,是否有miRNA-214和钙超载相关机制参与其中。方法在体实验分组：雄性Sprague-Dawley大鼠24只随机分为四组(n=6)：假手术组(Sham组)、Sham+电针组(sham+EA)、缺血-再灌注组(I/R组)、缺血-再灌注+电针组(I/R+EA组)。在心肌缺血-再灌注损伤实验前3天,每天对Sham+EA组、I/R+EA组的大鼠实施30min的双侧内关穴持续电针刺激。通过对I/R组及I/R+EA组大鼠冠状动脉左前降支(LAD)结扎并行缺血40min,再灌注180min来制备心肌缺血-再灌注模型。Sham组接受上述相同手术操作,但未行LAD结扎。离体实验分组：将H9c2细胞随机分为四组(n=3)：Control组、Control+电针组(Control+EA组)、氧糖剥夺组(OGD组)、氧糖剥夺+电针组(OGD+EA组)。Control+EA组和OGD+EA组细胞在OGD前10天,每天给予50Hz,0.5ms,17.3V,持续电刺激30min。对OGD组和OGD+EA组细胞经氧-糖剥夺(OGD)制作心肌细胞缺血-再灌注模型。在体实验将各组SD大鼠实施3.5%水合氯醛(50ml/kg)腹腔注射麻醉,之后大鼠取背位固定于实验台,行气管内插管及呼吸机通气。设定潮气量为20ml/kg,呼吸频率为50次/min。对大鼠四肢实施将大头针皮下穿刺后,将心电监护仪电极连接大头针并行心电持续监护和记录。之后,取通过左胸第四肋间隙切口切开皮肤并暴露心脏,用套有聚乙烯小管的6-0丝线结扎冠状动脉左前降支(LAD),此时大鼠心电图呈现出宽大畸形的QRS波,将此时点记录为心肌缺血开始时间。在心肌缺血40mmin时,将行冠状动脉左前降支结扎的丝线拉松以实施心肌再灌注,180min后剪取大鼠心脏以备后续实验。Sham组大鼠接受上述相同手术,但未行LAD结扎与松解。离体实验将单层H9c2细胞置于25mmol/L高糖的达氏修正依氏培养基上,使用10%的牛胎儿血清进行细胞培养,培养气体为含5% CO2的37℃空气。每3天更换一次培养基。同时在含有5.5mmol/L葡萄糖的普通培养基中进行对照细胞培养,并将细胞暴露于24.5mmol/L甘露醇来进行培养基高渗状态评估。在H9c2细胞10天之后,使用无糖DMEM替代上述全部培养基,并通过将各组的H9c2细胞在37℃含5% CO2和95% N2(v/v)的气体中培养10小时来进行氧-糖剥夺处理细胞模型的制备。在缺氧处理结束后,使用新鲜高糖DMEM替换之前的各组培养基,并加入10%的牛胎儿血清,将细胞置于含5% CO2的37℃空气的常规培养箱内。在体电针预处理将两支不锈钢毫针刺入Sham+EA组和I/R+EA组大鼠“内关”穴,即尺、桡骨缝间,距腕关节约3mm处,约3mm深。两毫针连接电针治疗仪的正、负电极,在心肌缺血-再灌注损伤实验前3天,每天给予持续电针刺激30min。电针刺激频率为4/20Hz,脉冲密度为0.5ms,强度为1mA,以大鼠前爪轻颤为度。离体电针预处理将一副铂链置于3.5厘米培养皿中,对H9c2细胞实施微电流刺激,铂链两极连接到电刺激仪,刺激频率50Hz,脉冲密度0.5ms,连续10天,每天持续刺激30min。分析比较在体和离体实验各组心肌细胞中miRNA-214的表达情况,钠/钙交换蛋白1(NCX1)、B淋巴细胞肿瘤因子2样蛋白11(BIM)、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱδ (CaMKⅡδ)和亲环素D(CypD)等相关蛋白浓度,以及细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)。结果I/R组miRNA-214的表达高于sham组(P<0.01)。sham+EA组和I/R+EA组的miRNA-214表达水平因电针预处理而有效上调。与Control组正常心肌细胞比较,电针刺激的心肌细胞和OGD处理的心肌细胞的miRNA-214表达均上调(P<0.01)。此外,OGD+EA组心肌细胞miRNA-214表达高于未经电刺激的OGD组心肌细胞(P<0.01)。Control组和OGD组经电刺激后[Ca2+]i均下调(P<0.05)。OGD处理细胞内[Ca2+]i显著高于对Con trol组,OGD+EA组细胞[Ca2+]i显著低于OGD组,P<0.01。OGD组NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等蛋白浓度高于Control组,OGD+EA组上述指标显著低于OGD组,P<0.05或P<0.01。结论 体内和体外实验结果证实电针和微电流预处理可通过上调miRNA-214表达,抑制OGD所致的Ca2+和NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等相关蛋白的升高,可在心肌缺血-再灌注时发挥有效的心脏保护作用。第3章miRNA-214/Ca2+-信号通路在电针预处理心肌缺血-再灌注损伤心肌保护中的作用和细胞分子机制目的通过对miRNA-214过表达和miRNA-214沉默模型相比较,来研究miRNA-214/Ca2+信号通路在电针预处理抗心肌缺血-再灌注损伤中的作用及其细胞分子机制。方法将H9c2细胞随机分为4组(n=3)：Sham组、氧糖剥夺组(OGD组)、氧糖剥夺+电针+miRNA-214沉默组(miR-NC组)、氧糖剥夺+电针+miRNA-214过表达组(miR-214组)。利用miRNA-214慢病毒进行基因转：处理,利用miRNA-214前体慢病毒进行基因沉默处理。在体外心肌缺血-再灌注模型构建前10天,将miRNA-214慢病毒和miRNA-214前体慢病毒分别注入miR-214组和miR-NC组H9c2细胞,以制备miRNA-214过表达和基因沉默模型。miR-NC组和miRNA-214在OGD前10天,每天给予电刺激30mmin。对OGD组、miR-NC组、miR-214组细胞经氧糖剥夺制作心肌细胞缺血-再灌注模型。使用线粒体慢病毒并按照相关使用手册对H9c2细胞进行miR-NC或miR-214转染。操作成功之后将细胞冲洗并保存于培养基。将单层H9c2细胞置于25 mmol/L高糖的达氏修正依氏培养基上,使用10%的牛胎儿血清进行细胞培养,培养气体为含5% CO2的37℃空气。每3天更换一次培养基。同时在含有5.5mmol/L葡萄糖的普通培养基中进行对照细胞培养,并将细胞暴露于24.5mmol/L甘露醇来进行培养基高渗状态评估。在H9c2细胞10天之后,使用无糖DMEM替代上述全部培养基,并通过将各组的H9c2细胞在37℃含5% CO2和95% N2(v/v)的气体中培养10小时来进行氧-糖剥夺处理细胞模型的制备。在缺氧处理结束后,使用新鲜高糖DMEM替换之前的各组培养基,并加入10%的牛胎儿血清,将细胞置于含5%CO2的37℃空气的常规培养箱内。将一副铂链置于3.5厘米培养皿中,法对H9c2细胞实施微电流刺激,铂链两极连接到电刺激仪,刺激频率50Hz,脉冲密度0.5ms,连续10天,每天持续刺激30min。提取细胞上清液并行乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性检测。检测并比较各组H9c2细胞凋亡情况,miRNA-214的表达情况,及钠/钙交换蛋白1 (NCX1)、B淋巴细胞肿瘤因子2样蛋白11(BIM)、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)和亲环素D (CypD)等相关蛋白浓度,以及细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)。结果sham组、OGD组、miR-NC组、miRNA-214组四组细胞凋亡率分别为9.86±3.98%、15.8±2.26%、46.9±4.41%、17.35±1.34%。Sham组中细胞凋亡不明显,OGD组中有一定的细胞凋亡现象发生,miRNA-214组中细胞凋亡情况略低于OGD组,miR-NC组细胞凋亡情况发生显著高于其他各组。miRNA-214血浆LDH和CK活性低于miR-NC组(P<0.01)。miRNA-214组miRNA-214 mRNA表达水平,较miR-NC组增加约3倍(P<0.01)。miRNA-214组[Ca2+]i显著低于miR-NC组(P<0.05)。miRNA-214组NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等蛋白水平均显著低于miR-NC组(P<0.01)。结论miRNA-214/Ca2+信号通路参与电针预处理心肌缺血-再灌注损伤心肌保护中的作用和细胞分子机制。论文主要结论1、体内和体外实验结果证实体内双内关穴电针和体外微电流预处理可有效保护心脏对抗心肌缺血-再灌注损伤。2、体内和体外实验结果证实体内双内关穴电针和体外微电流预处理可通过上调miRNA-214表达,抑制OGD所致的Ca2+和NCX1、BIM、CaMKⅡδ和CypD等相关蛋白的升高,在心肌缺血-再灌注时发挥心脏保护作用。3、miRNA-214/Ca2+信号通路参与电针预处理心肌缺血-再灌注损伤心肌保护中的作用和细胞分子机制。