论文部分内容阅读
生殖细胞核受体(Germ cell nuclear factor, GCNF)和类固醇生成因子(Steroidogenic factor1, SF-1)是核受体超家族中的孤儿核受体成员,它们在胚胎发育、性腺分化、内分泌及生殖调控等多个方面发挥十分重要的作用。本研究以本地沼泽型水牛和家猪为研究对象,应用RT-PCR的方法克隆GCNF和SF-1基因的编码区序列,通过qRT-PCR技术分析GCNF和SF-1在不同组织的表达,并应用免疫组化技术对其蛋白在卵巢和睾丸组织的定位进行分析。此外还应用qRT-PCR系统地研究了GCNF和SF-1基因在卵泡发生和早期胚胎发育过程中的表达规律,并从甲基化和miRNA两个层面对其基因表达调控的分子机制进行了探讨。主要研究结果如下：1. GCNF和SF-1基因全长编码区序列片段的克隆。测序结果显示水牛和猪GCNF基因包含全长编码区片段大小分别为1391bp和1572bp,分别编码435和450个氨基酸残基。多重序列比较结果显示,水牛GCNF基因氨基酸序列与猪、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分别为97%、97%、97%、96%和97%。水牛和猪SF-1基因包含全长编码序列的扩增片段大小分别为1490bp和2002bp,均编码461个氨基酸残基。多重序列比较结果显示,水牛SF-1基因氨基酸与猪、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分别为96%、98%、94%、94%和95%。在氨基酸和核苷酸水平上GCNF和SF-1基因在不同物种中具有较高保守性。蛋白二级结构分析结果显示GCNF和SF-1蛋白主要以p-转角和无规则卷曲为主,其次是α-螺旋,β-折叠较少,两种蛋白均含有锌指结构和配体结合域结构,具备结合DNA特征的典型核受体结构。2.不同组织基因表达谱构建及在性腺组织中的定位。应用qRT-PCR技术,检测了GCNF和SF-1基因在水牛不同组织的表达。结果显示,水牛GCNF基因在睾丸(相对表达量为24.9±0.02)和卵巢(24.1±0.16)组织表达水平较高,显著高过在皮肤(1.0±0.29)、肾脏(0.77±0.11)、大脑(0.48±0.26)、肝(0.46±0.02)、生殖嵴(0.45±0.02)、肌肉(0.43±0.01)、骨骼(0.31±0.26)和垂体(0.25±0.01)等组织的表达。水牛SF-1在睾丸(17.8±0.16)、卵巢(12.1±0.03)及生殖嵴中(7.7±0.02)表达水平较高,在大脑(3.1±0.01)、肝脏(1.8±0.12)、皮肤(1.8±0.11)和垂体(1.0±0.3)有一定的表达,而肾脏(0.79±0.68)、骨骼(0.65±0.03)和肌肉(0.58±0.18)等组织表达量均较低。免疫组化结果显示GCNF基因在卵巢中原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均呈强阳性且主要在细胞核中表达,在次级卵泡和有腔卵泡中,卵泡膜细胞和壁颗粒细胞呈强阳性,而卵丘细胞和卵母细胞呈弱阳性；SF-1基因在原始卵泡的卵母细胞核中呈强阳性染色,在初级和次级卵泡中的颗粒细胞和卵母细胞中均呈强阳性,在有腔卵泡中,卵丘细胞呈强阳性染色,而在卵母细胞中表达量较弱。在睾丸组织中,GCNF和SF-1蛋白均存在于曲细精管生精上皮的生精细胞中,推测GCNF和SF-1在卵泡发生和精子发生过程中起着重要的作用。3.卵母细胞成熟前后和早期胚胎中的表达谱研究。应用Cells to cDNA和qRT-PCR的方法检测了卵母细胞成熟前后GCNF和SF-1的表达水平,结果显示GCNF、SF-1在水牛和猪COCs成熟过程中持续有表达,并且在成熟后的表达量较成熟前明显下调。在早期胚胎发生过程中,GCNF在2cell时期表达最高(相对表达量为1±0.03),随后表达量先降低后缓慢回升,桑椹胚至囊胚期表达突然下降至几乎检测不到表达(0.01±0.04)。SF-1在2cell到8cell期表达量基本无明显变化,8cell到桑椹胚期表达量极显著上升至峰值(6.89±0.35),到囊胚期表达量又骤然下降至几乎没有表达(0.001±0.3)。应用亚硫酸盐甲基化修饰测序检测了GCNF和SF-15’调控区域CpG岛甲基化水平,结果显示GCNF在COCs成熟前甲基化程度要低于成熟后(48.8%vs87.8%)；而SF-1在COCs成熟前后甲基化程度无明显变化(3.2%vs3.2%)。4.探讨miRNA参与GCNF和SF-1基因表达调控的机制。通过3’RACE技术成功克隆了猪GCNF和SF-1的3’UTR序列,长度分别为1816bp和893bp。应用Microinspector软件预测筛选发现ssc-miR-181a和ssc-miR-615在GCNF和SF-13’UTR中具有结合位点,qRT-PCR显示两个miRNA在猪孤雌早期胚胎的表达规律,与GCNF、SF-1的表达规律相比,存在着此消彼长的关系,由此推测ssc-miR-181a和ssc-miR-615参与了GCNF和SF-1基因在早期胚胎发生中的表达调控过程。