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CRISPR是一种新型的基因编辑技术,被比喻为精确的分子手术刀,对人类致病基因的挖掘,疾病的靶向治疗,农业作物的品种改良,定向育种都具有巨大的潜力与前景。此项技术操作简单易行,而且实验周期短,成本节约,易于在实验室中开展。CRISPR技术先后应用于植物,动物及人体细胞中。蛹虫草作为一种食药用真菌,很多功效都接近于冬虫夏草,具有减缓疲劳,软化心血管,抗肿瘤,防辐射等作用,产业化生产蛹虫草子实体体系已建立。目前尚未有蛹虫草遗传转化体系建立的报道,本实验首次在蛹虫草中建立遗传转化体系,并首次利用CRISPR技术对蛹虫草中尿嘧啶合成的关键酶基因URA3进行基因编辑,使其成为一种新型的筛选标记,为进一步研究蛹虫草的代谢调控,菌种优化奠定了基因工程基础。实验中使用正交的方法,对农杆菌介导蛹虫草转化的条件进行优化,得到最优的农杆菌转化条件,建立农杆菌介导蛹虫草原生质体遗传转化体系。成功克隆了真菌GPD启动子,并将其成功构建到敲除载体pFGC-pcoCas9上,从而实现了对植物敲除载体的改造,最终得到适用于蛹虫草的敲除载体。运用农杆菌遗传转化法,将其敲除载体转入到蛹虫草原生质体中,最后得到了突变的转化子,并且稳定遗传,达到了转化的目的和效果。实验的具体结果如下所示:1.通过影响蛹虫草原生质体提取效率因素的探究,将蛹虫草菌球培养4天,经过蜗牛酶与溶壁酶组合,以1:1的比例,酶解4小时后,蛹虫草的原生质体提取平均达到1×107个/mL。2.通过抗生素对蛹虫草原生质体敏感度的实验,得到蛹虫草原生质体的最佳筛选浓度组合:潮霉素+卡那霉素:650 mg/L+300 mg/L。3.使用正交法研究农杆菌遗传转化对转化效率的影响,并使用荧光蛋白基因验证。最终确定,最佳的转化条件为:诱导剂乙酰丁香酮浓度为200μM/L,农杆菌与蛹虫草原生质体的体积比为100:1,共培养时间为2天。4.克隆GPD启动子,将其成功构建到敲除载体pFGC-pcoCas9上,并将URA3基因序列的gRNA连入载体中,得到适用于本实验的载体。5.通过农杆菌介导蛹虫草的遗传转化,将敲除载体成功转入蛹虫草中并得到转化子。6.利用0.9%的生理盐水冲洗阳性转化子,进行4次的继代,结果显示,转化子可稳定遗传且仍然对抗生素具有敏感性。证明农杆菌介导蛹虫草原生质体的遗传转化法成功建立。