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在真核细胞中,编码蛋白的转录是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)通过一系列复杂且有序的调控机制来完成。过去,转录起始前复合物的组装和调控被认为是细胞应答信号、调节基因转录的核心,但近年已逐渐认识到转录延伸也是一个高度有序,极为精细的调控平台,其调控机理甚至比转录起始更加复杂。其中正性转录延伸因子b复合体(positive transcription elongation factor b,P-TEFb复合体)被证明是整合转录起始和延伸的最重要因子之一.P-TEFb是由激酶CDK9及CvclinT1组成的异二聚体,在转录延伸过程中可磷酸化RNA polⅡ大亚基CTD上第2位丝氨酸,并克服负性转录延伸因子对转录延伸的抑制作用,从而保证全长mRNA的合成。
作为基本转录因子,P-TEFb复合体不仅调控细胞增殖,胚胎发育及免疫应激相关基因的转录表达,也与艾滋病、心肌肥大及肿瘤等恶性疾病的发病机理相关。有关P-TEFb复合物的生物学功能及其活性调控机制在不断探索中。近年来,研究人员已经逐渐揭示出P-TEFb复合物活性调控的分子模式,及其活化的信号途径和分子机制。但对于P-TEFb复合物行使其生物学功能最关键的环节之一,即如何被Brd4募集到启动子区激活基因转录缺乏重视和了解,其关键原因是缺乏相应的技术以至于无法在细胞水平上分离游离状态和结合在染色质上的P-TEFb/Brd4复合物。本实验室通过改进后新建立的细胞核分级抽提法打破了这个技术瓶颈,从而可以较为顺利的探索Brd4募集P-TEFb的分子机制。我们前期研究表明:外来信号刺激下,Brd4应激活化,即结合在染色质上的Brd4从染色质上解离下来,将有活性的P-TEFb复合物募集到启动子区促进相关基因的转录。
本文对调控Brd4应激活化的信号途径及其分子机制展开研究,发现Brd4的应激活化需要通过两条不同的信号途径协同作用来完成。我们采用紫外线(UV)和阿霉素(DOX)处理来研究Brd4应激活化的信号途径。Brd4通过结合乙酰化的组蛋白而结合在染色质上,表明Brd4从染色质上解离与组蛋白去乙酰化酶HDAC有关。我们采用特异性抑制剂和shRNA敲除的方法筛选出HDAC1/2/3参与调控Brd4的应激活化。但之后发现该途径单独不能激活Brd4,提示需要第二条信号通路的协同作用。接下来鉴定发现蛋白磷酸酶PP1α信号途径也是必需的途径之一,而且和HDAC信号途径相类似,PP1α途径单独同样也不能起作用。采用体外共处理细胞核的实验,发现PP1α和HDAC1/2/3能直接并且有效地协同作用,从而导致Brd4从染色质上解离。进一步的研究发现PP1α对组蛋白H3S10的去磷酸是HDAC1/2/3对组蛋白H4K5/K8的去乙酰化的前提条件。Brd4敲除和高盐抽提表明H3S10的去磷酸化先于H4K5/K8的去乙酰化与Brd4无关,可能属于组蛋白的Crosstalk。因此,我们研究表明外界信号刺激可激活PP1α和HDAC1/2/3两条主要信号途径协同作用,导致Brd4从染色质上解离,募集P-TEFb,其中PP1α对H3S10去磷酸化造成的组蛋白Crosstalk有利于HADC1/2/3对H4K5/K8去乙酰化,最终导致Brd4从染色质上解离。