论文部分内容阅读
马铃薯甲虫是取食马铃薯叶片的重要害虫,常引起马铃薯产量的巨大损失。长期的化学杀虫剂使用导致抗药性快速发展,这使防治难度变得更大。研究发现,谷胱甘肽转移酶(glugathione S-transferase,GST)活性增强导致马铃薯甲虫幼虫对伏杀硫磷及氯菊酯的抗性。我们之前增效剂测定实验也表明,GST可能参与多种杀虫剂的解毒代谢。目前,马铃薯甲虫的GST基因家族尚未系统鉴定,参与杀虫剂代谢的GST基因也尚未明确。有鉴于此,本文主要开展了以下3个方面的工作。一、马铃薯甲虫GST基因挖掘及鉴定基于马铃薯甲虫的基因组和转录组数据,经过同源搜索和基因预测,发现34个GST候选序列。采用RT-PCR验证了上述候选GST基因序列的正确性,应用RACE技术获得了部分GST基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为KU522306-KU522339)。结合赤拟谷盗、黑腹果蝇、家蚕、西方蜜蜂、冈比亚按蚊和豌豆蚜的GST蛋白,建立了系统发育树,分析了它们的系统进化。最终,我们获得了 30个GST基因,其中29个基因编码细胞质GST,1个基因编码微粒体GST。29个细胞质基质基因中,3、10、5、4、4、1 个基因分属于 delta、epsilon、omega、sigma、theta 和 zeta 亚家族。另外2个GST基因不属于已知亚家族而未能归类。二、马铃薯甲虫GST基因结构分析通过对GST基因进行系统发育及结构分析,我们发现,30个GST基因分布在17个染色体骨架(scaffolds)上。10个epsilon亚家族的GST基因中,有8个(LdGSTe1至LdGSTe8)分布在染色体骨架12上,2个(LdGST9和LdGSTe10)分布在染色体骨架1223上。亚家族epsilon的GST基因在染色体上的位置与系统发育树中预测的进化过程是一致的。另外,马铃薯甲虫中2个omega亚家族和1个sigma亚家族GST基因位于染色体骨架134。3个sigma亚家族GST基因位于scaffold 521。2个未归类GST基因位于染色体骨架615。其他GST基因则分别位于不同的染色体骨架。还分析了马铃薯甲虫GST基因的内含子-外显子结构。30个GST基因共包含83个内含子。平均每个GST基因包含2.8个内含子。不存在不包含内含子的基因。另外,我们还发现LdGSTe2、LdGST4和LdGSTo3存在多个可变剪切体。三、三种杀虫剂(高效氯氰菊酯、氟虫腈、硫丹)诱导GSTs的表达动态经高效氯氰菊酯处理后存活的马铃薯甲虫,其LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTe10、LdGSTu2、LdGSTo5 和LdGSTt1表达水平分别上调 18.0、9.8、3.4、11.8、4.9 和 21.4倍。与此类似,氟虫腈处理后,LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTo5和LdGSTt1分别上调了 3.6、28.3、4.8和 6.6 倍。硫丹处理后,LdGSTd1、LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTu2、LdGSTo5和LdGSTt1的转录水平分别上调了 4.9、5.9、13.8、9.4、12.0和4.1倍。高效氯氰菊酯处理后,LdGSTe4和LdGSTe6的mRNA表达水平显著下降。氟虫腈处理明显降低了 LdGSTe4、LdGSTe6和LdGSTe10的转录水平。硫丹处理明显降低了LdGSTe4、LdGSTe6 和 LdGSTz1 的表达水平。