论文部分内容阅读
背景转移一直是结直肠癌患者术后复发和治愈效果不良最主要的因素。如今关于肿瘤转移的机制主要有肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)学说、上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)、肿瘤细胞的凋亡以及肿瘤器官的特异性转移等。其中,CSC学说是近来研究肿瘤转移的热点。CSC学说认为在癌组织里可能有一小部分细胞在连续的体内移植实验中具有独特的产生和维持肿瘤生长的能力以及肿瘤异质性的能力。这部分细胞即为CSC[1]。研究者认为转移肿瘤干细胞(Migrating Cancer Stem Cell,MCSC)是隶属于CSC的亚群,在结直肠癌的转移中起着至关重要的作用[2]。MCSC与CSC最主要的区别就是其具有形成转移瘤的潜能[3]。目前,研究者们对于结直肠癌CSC的标志物研究已经趋于成熟,但关于MCSC的研究才刚刚起步,寻找MCSC关键的标志物才能更准确地解密肿瘤转移的机制。目的1.选用结直肠癌细胞系立体培养CSC克隆球。2.动物盲肠原位种植模拟结直肠癌体内肿瘤转移。3.筛选并验证结直肠癌MCSC的关键分子标志物。方法我们采用了无血清干细胞球立体培养与裸鼠原位种植相结合的方式获取高纯度MCSC,这既解决了 MCSC获取来源有限的难题,又提高其所得纯度,此为本实验的创新之处。接下来通过基因芯片技术发现发生转移的裸鼠身上盲肠原发灶与其他器官转移灶之间确实有基因表达的差异,并筛选出与MCSC相关的基因。随后通过人新鲜标本来验证所得的差异基因,与裸鼠样本所得结果一致。最后通过免疫组化获取差异基因在蛋白水平的表达状况。结果1.富集CSC球:肿瘤球在培养5-6天时形成,细胞呈桑葚样折光性好,细胞排列紧密,不能准确地区分细胞之间的边界。随着培养时间的增加,肿瘤球的体积是逐渐增大的。2.MCSC体内转移模型的建立:将约600个肿瘤球皮下注射到裸鼠体内,所有裸鼠均出现皮下瘤,成瘤率为100%。建立裸鼠原位种植模型结果如下:H2组有4/6只裸鼠出现转移瘤,C2组有3/6只出现转移瘤,S2组有4/6只出现转移瘤。3.差异表达基因分析:通过比较发现了 3条差异表达mRNA:CRYAB、KCNMA1、SERPING1。KEGG及GO分析显示这些基因均可能与MCSC相关。4.实时荧光定量PCR及免疫组化结果:我们利用实时荧光定量PCR技术均验证出CRYAB、KCNMA1及SERPING1在动物及人结直肠癌的转移灶中的表达量高于原发灶中的表达量,差异具有统计学意义(P<0.05)。随后我们通过免疫组化验证出CRYAB、KCNMA1及SERPING1蛋白在人淋巴结转移癌组织中的阳性率分别为:60%、80%及90%,均高于原发癌组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.成功培养出了结直肠癌CSC克隆球,用其建立的裸鼠皮下移植模型的致瘤能力较普通细胞系强400倍。2.成功建立了裸鼠盲肠原位种植癌转移模型。3.采用mRNA芯片技术筛选出原发癌CSC及转移癌组织MCSC中3个差异表达基因CRYAB、SERPING1及KCNMA1,并进一步验证其与促结直肠癌的转移相关,但仍需进一步的功能和机制研究验证是否为结直肠癌MCSC标志物。