论文部分内容阅读
背景近年来随着胃癌相关诊疗技术的不断进步,胃癌患者的总体生存率得到了显著提高,但其整体治疗效果仍不十分理想。肿瘤的增殖、侵袭和转移是其重要的恶性生物学行为,从根本上寻找肿瘤发生、发展及恶性生物学行为的调节机制,可以有效提高胃癌的治疗效果。目的研究LIF在胃癌中的表达情况与病理学参数及预后的相关性,评价其在胃癌诊断方面的价值,探索LIF对胃癌细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为的影响,并进一步探讨具体作用机制。方法1.利用ELISA技术检测208例胃癌患者、67例慢性萎缩性胃炎患者和70例正常人LIF因子外周血表达水平。免疫组织化学染色检测128例胃癌石蜡切块LIF和LIFR在组织中的表达。通过Western blot和qRT-PCR方法检测40例胃癌新鲜组织样本及配对的癌旁正常组织中LIF和LIFR蛋白和mRNA的表达情况,并与临床病理学参数及预后进行相关性分析。2.筛选LIF低表达、LIFR高表达的胃癌细胞株(Western blot和qRT-PCR方法)。利用RNA干扰技术,借助质粒为载体,敲低胃癌细胞株中LIFR的表达。通过CCK-8、EdU和平板克隆实验检测加入外源性LIF因子及沉默LIFR基因后,对胃癌细胞增殖能力的影响。采用流式细胞技术检测LIF及沉默LIFR对胃癌细胞的细胞周期分布和凋亡的影响。采用Transwell实验观察LIF及沉默LIFR对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响。通过裸鼠体内成瘤模型探讨LIF及沉默LIFR后对肿瘤生长的影响。3.Western blot法和细胞免疫荧光染色技术检测LIF对Hippo-YAP信号通路中核心元件的影响及相互关系。利用siRNA沉默信号通路下游YAP蛋白表达后,通过CCK-8实验检测LIF是否主要通过Hippo-YAP信号对胃癌细胞增殖产生影响。结果1.胃癌患者、慢性萎缩性胃炎患者、正常人外周血LIF水平分别为8.650±6.282 pg/ml、4.325±1.824 pg/ml、3.344±1.918 pg/ml。胃癌患者LIF水平明显高于慢性萎缩性胃炎患者(P=0.003)和正常人(P<0.001)。LIF诊断胃癌的界值为5.585 pg/ml,诊断敏感度：88.14%,特异度：81.82%,准确度：85.64%。免疫组化结果显示：LIF和LIFR在胃癌中的阳性表达率明显高于正常粘膜(P<0.001),与肿瘤分化程度(P=0.021)、脉管浸润(P=0.001)、T分期(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.001)及pTNM分期(P=0.012)存在相关性。相同肿瘤组织中LIF与LIFR的蛋白表达量及mRNA含量呈正性相关(P<0.001,P<0.001)。利用Cox回归多因素生存模型分析患者的预后相关因素发现LIF及LIFR与预后紧密相关,是独立的预后风险因素(P=0.009, P=0.034)。 2.MGC803细胞在几种常见胃癌细胞系中LIF的表达量最低,LIFR的表达量最高。加入外源性LIF可以显著增强细胞的增殖、侵袭、迁移、抗凋亡能力和裸鼠体内成瘤速度(P<0.001)。沉默LIFR后,与阴性对照组相比,细胞的上述恶性生物学行为能力被明显减弱,且在LIFR被沉默的细胞中再次加入LIF无法发挥上述LIF的肿瘤促进作用。3.LIF可以显著降低Hippo-YAP信号通路中核心元件的磷酸化水平(P<0.001),并促进YAP蛋白的核内转移。另外,LIF无法促进YAP-siRNA细胞的增殖。结论1.LIF参与了胃癌内在的发生过程,能够用于胃癌的诊断,并且与胃癌的增殖、侵袭、转移及患者预后紧密相关。2.LIF可以促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移等恶性生物学行为,而沉默LIFR可以抑制肿瘤的发生、发展。在LIFR表达被沉默后,再次加入LIF无法发挥其作用,提示LIF是与其受体LIFR结合,增强肿瘤的恶性生物学行为能力。3.LIF可以有效降低细胞内MST1/2、LATS1和YAP磷酸化蛋白的含量,从而抑制了Hippo-YAP通路中的核心元件,最终促进YAP的核内转移。4.LIF在胃癌的发生、进展、侵袭和转移中起到了重要作用,能够成为未来胃癌靶向治疗的重要研究方向。运用LIF抗体或沉默LIFR的表达可以成为一种新型的胃癌个体化治疗手段。