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研究背景:胆囊癌(Gallbladder Carcinoma,GBC)是常见的胆道系统肿瘤,早期无特异性的临床表现,发现时往往已到临床中晚期,预后较差。临床上GBC确诊时,多半已经发生了邻近器官浸润和/或通过血液系统发生远处转移,很难进行根治性手术,且手术效果较差,术后五年生存率不足5%。近年的流行病学调查调查显示我国大部分地区GBC发病率呈明显上升趋势。因此,提高GBC患者的远期生存率除了要在手术结合放化疗方面进一步规范和探索外,还应该在分子水平上进一步研究GBC的发生、发展及其侵袭的机制。通过在分子水平的研究、探索GBC的生物学行为,寻找特异性生物学标记提高早期诊断率,针对发病基因进行分子靶向治疗并在预后评估等方面进行探索。这也是目前GBC分子生物学研究的重点、热点方向之一。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类内源性非编码短链RNA,约22个核苷酸大小,它主要通过与靶m RNA的3’UTR不完全性互补配对抑制m RNA的翻译,介导转录后基因调控。mi RNA不仅在细胞的增殖、分化和凋亡等生物学功能起到重要的调控作用,而且和肿瘤的发生发展、转移等生物学效应密切相关。PTEN是迄今为止发现的第一个具有双重磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN基因编码的蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重特异性磷酸酶活性,与多种肿瘤的发生、发展密切相关。本课题组发现在GBC-SD细胞系中mi RNA-21表达水平与PTEN表达密切相关,并进一步实验证实在GBC-SD细胞系中PTEN为mi RNA-21靶基因,初步认为mi RNA-21通过抑制PTEN基因影响了GBC发生、发展的可能机制;同时mi RNA-21与细胞紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达密切相关,提示mi RNA-21可能参与GBC的侵袭与迁移。这为进一步研究mi RNA-21在GBC生物功能的机制拓宽了思路。方法:1.在GBC-SD细胞系沉默micro RNA 21;1)沉默mi RNA-21后分别在m RNA和蛋白水平检测PTEN、紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1蛋白表达水平;2)在GBC-SD细胞系过表达/抑制mi RNA-21表达,分别检测PTEN的蛋白水平和m RNA水平变化;2.Transwell assay检测GBC-SD细胞系沉默mi RNA-21后细胞迁移与侵袭能力;3.荧光素酶实验检测PTEN与mi RNA-21的相互作用机制;4.收集67例GBC临床标本,原位杂交技术检测mi RNA-21,免疫组化SP法检测PTEN、ZO-1和occludin表达水平;5.采用对mi RNA-21与临床参数、PTEN等指标进行相关性分析;Kaplan-Meier方法进行生存分析,并采用Log-rank检验比较两组生存率;采用Cox风险比例模型进行各个协变量的联合效应分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.发现micro RNA 21与PTEN、紧密连接蛋白之间的关系:1)沉默micro RNA 21后,PTEN表达上调,Occludin、ZO-1蛋白水平升高;2)沉默micro RNA 21后,发现Occludin、ZO-1m RNA表达上升。2.证实mi RNA-21与PTEN在GBC中的表达负相关:1)GBC-SD细胞中过表达mi RNA-21可下调PTEN的m RNA和蛋白表达;2)GBC-SD细胞中抑制mi RNA-21可上调PTEN的m RNA和蛋白表达;3)GBC-SD细胞中抑制mi RNA-21后,细胞迁移与侵袭能力明显减弱;4)PTEN的3’UTR是mi RNA-21的靶序列;5)GBC患者术后生存结果分析显示,mi RNA-21表达与患者预后呈反比。结论:1.在GBC-SD细胞中mi RNA21可被沉默;体外实验证实mi RNA21基因表达与PTEN、紧密连接蛋白表达水平密切相关;在进一步的GBC-SD细胞和动物实验证明沉默mi RNA21后,GBC侵袭和转移能力减弱;2.初步认为PTEN的3’UTR是mi RNA-21在GBC细胞中作用的靶区域,mi RNA21可通过抑制靶基因PTEN的功能参与GBC的发生、发展;GBC病人癌组织mi RNA21表达上调,其表达与肿瘤的TNM分期相关,且高表达患者生存期短,预后差。mi RNA21或可成为GBC治疗的靶目标。