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目的:肺癌是全世界最为常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在癌症中均居第一位,随着肺癌病程的发展,癌细胞极易发生侵袭、转移,这也是肺癌难以治愈,生存率低的主要原因。目前治疗肺癌方式不足,亟需研究开发新的抗肺癌药物,以延长患者的生存期,提高患者的生存质量。中药重楼(Rhizoma Paridis)是传统中医配伍抗癌方剂的常用药物,现代药理学研究证明重楼具有抗肿瘤、镇定止痛、抑菌消炎等作用,重楼皂苷是其主要活性成分。目前研究报道较多的是常见重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ,事实上重楼中还有很多具有生物活性的皂苷类成分。此外,相关的研究多为探讨重楼皂苷诱导癌细胞凋亡和自噬性死亡,关于重楼皂苷抑制癌细胞侵袭、转移作用及相关机制尚未见广泛报道。基于以上相关资料,本研究拟选取肺腺癌A549细胞模型作为研究对象,研究九种重楼皂苷单体(重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、纤细薯蓣皂苷、17-羟基纤细薯蓣皂苷)对A549细胞生长抑制及侵袭、转移作用的影响;并通过以上实验结果筛选出抑制作用强的重楼皂苷Ⅱ进行深入研究,从PI3K/AKT/mTOR信号通路切入,阐述重楼皂苷Ⅱ抑制侵袭和转移作用的分子机制;同时考察了重楼皂苷Ⅱ的平衡溶解度、稳定性及油水分配系数,为后续相关制剂的研究奠定基础。方法:1.培养肺腺癌A549细胞,采用MTT法检测不同浓度的九种重楼皂苷单体对A549细胞增殖的抑制作用,绘制细胞活性曲线图,计算九种重楼皂苷作用A549细胞24 h、48 h的IC50值,并选择适宜的药物浓度及作用时间进行后续实验。2.利用Transwell小室体外侵袭模型检测不同浓度的九种重楼皂苷对A549细胞侵袭作用的影响。3.利用划痕实验检测九种重楼皂苷对A549细胞迁移作用的影响。4.采用Real-time PCR检测经不同浓度的重楼皂苷Ⅱ处理后,A549细胞中与侵袭和转移相关基因MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA的相对表达水平。5.采用Western blot法检测经不同浓度的重楼皂苷Ⅱ处理后,A549细胞中MMP-1、MMP-2和MMP-9蛋白水平的变化以及其上游PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白磷酸化水平的变化。6.采用紫外分光光度法确定检测重楼皂苷Ⅱ的最佳波长,测定重楼皂苷Ⅱ的平衡溶解度、稳定性以及油水分配系数。结果:1.九种重楼皂苷单体对A549细胞的生长均表现出较强的抑制作用,且呈现出一定量效性和时效性。重楼皂苷Ⅰ作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为0.65、0.52μmol/L,重楼皂苷Ⅱ作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为0.87、0.56μmol/L,重楼皂苷Ⅲ作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为1.51、1.04μmol/L,重楼皂苷Ⅴ作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为2.13、1.57μmol/L,重楼皂苷Ⅵ作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为5.87、3.90μmol/L,重楼皂苷Ⅶ作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为2.44、1.85μmol/L,重楼皂苷H作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为3.05、2.60μmol/L,纤细薯蓣皂苷作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为2.58、1.89μmol/L,17-羟基纤细薯蓣皂苷作用A549细胞24 h、48 h后的IC50值分别为8.14、6.82μmol/L。2.九种重楼皂苷单体均能明显抑制A549细胞的侵袭能力。重楼皂苷Ⅰ(0.25、0.5μmol/L)、重楼皂苷Ⅱ(0.3、0.6μmol/L)、重楼皂苷Ⅲ(0.5、1.0μmol/L)、重楼皂苷Ⅴ(0.75、1.5μmol/L)、重楼皂苷Ⅵ(2.5、5.0μmol/L)、重楼皂苷Ⅶ(0.75、1.5μmol/L)、重楼皂苷H(1.25、2.5μmol/L)、纤细薯蓣皂苷(0.75、1.5μmol/L)、17-羟基纤细薯蓣皂苷(3.0、6.0μmol/L)分别作用A549细胞24 h后,与空白对照组相比,穿过Transwell底膜的细胞数量明显降低,且随重楼皂苷浓度增加,穿过Transwell底膜的细胞数随之减少。3.九种重楼皂苷均能明显抑制A549细胞的迁移能力。重楼皂苷Ⅰ(0.5μmol/L)、重楼皂苷Ⅱ(0.6μmol/L)、重楼皂苷Ⅲ(1.0μmol/L)、重楼皂苷Ⅴ(1.5μmol/L)、重楼皂苷Ⅵ(5.0μmol/L)、重楼皂苷Ⅶ(1.5μmol/L)、重楼皂苷H(2.5μmol/L)、纤细薯蓣皂苷(1.5μmol/L)、17-羟基纤细薯蓣皂苷(6.0μmol/L)作用A549细胞48 h后,其迁移水平相对于空白对照组分别降低了47.90%、55.15%、36.66%、32.43%、62.53%、47.23%、63.72%、50.46%、34.80%。4.Real-time PCR检测结果显示经重楼皂苷Ⅱ(0.5、1.0μmol/L)处理后,A549细胞中MMP-1、MMP-2以及MMP-9 mRNA的相对表达水平明显降低,且呈一定的浓度依赖性。5.Western blot检测结果显示经重楼皂苷Ⅱ(0.5、1.0μmol/L)处理后,A549细胞中MMP-1、MMP-2以及MMP-9蛋白表达水平明显下调,其上游PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白磷酸化水平也明显降低。6.重楼皂苷Ⅱ在pH值分别为2.0,3.0,3.8,5.0,6.8,7.0,7.8磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度分别是33.680,21.487,23.371,29.626,32.146,69.001,81.286μg/mL;重楼皂苷Ⅱ在pH值为2.0,3.0,3.8,5.0,6.8,7.0,7.8磷酸盐缓冲液中的油水分配系数分别为0.116,0.218,0.266,0.288,0.538,0.436,0.493,重楼皂苷Ⅱ在9 h内于不同pH条件下较稳定。结论:1.九种重楼皂苷均能明显抑制A549细胞增殖,提示其在体外具有较好的抗肺癌作用,其中重楼皂苷Ⅰ抑制作用最强,重楼皂苷Ⅱ次之;2.九种重楼皂苷均能抑制A549细胞的侵袭和转移,其中重楼皂苷Ⅱ对A549细胞侵袭及转移的抑制作用较为突出;3.重楼皂苷Ⅱ抑制肺癌A549细胞的侵袭和转移作用可能与降低金属蛋白酶家族的MMP-1、MMP-2和MMP-9基因和蛋白的表达有关;4.重楼皂苷Ⅱ通过介导A549细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路调控下游功能性蛋白,抑制A549细胞的侵袭和转移,发挥抗肿瘤作用。5.重楼皂苷Ⅱ的水溶性差,在弱碱性条件下溶解度较大,随pH值增大其溶解度相应增加,重楼皂苷Ⅱ长时间稳定性不佳,重楼皂苷Ⅱ的lgP均小于1,随pH变化的影响不大,说明其膜渗透性较差,脂溶性较差,不适合作为常规口服制剂开发使用。