[研究背景]面神经位置表浅,出颅后行程复杂易变,各种外伤或邻近部位的手术均易造成其损伤,导致部分性或完全性面瘫,严重影响功能和外观。尽管目前各种神经修复技术日趋精益,但临床观察发现术后神经功能的恢复难臻满意。究其主要原因,面神经损伤后不但外周神经干发生退行性变,而且中枢核团内也发生了极为复杂的反应。神经元核团微环境的营养和导向作用对受损神经的有效再生具有重要意义。而在中枢神经系统中,胶质细胞广泛分布,对神经元起物理支持、提供营养、维持周遭液体环境稳定、形成髓鞘、绝缘保护、清除病原体和死亡神经元等多种作用。因此,加强对面神经损伤后核团内胶质细胞微环境的认识,可以为其修复再生提供一定的理论基础。目前,已有大量实验研究表明,小胶质细胞、星形胶质细胞在面神经离断后核团区发生了一系列的反应。然而,对于近来发现的,同样广泛存在于CNS中,能对多种中枢神经系统疾病或损伤作出强烈反应的NG2阳性细胞,在面神经核团区生理和病理情况下均未见研究报道。而且这类细胞的功能和作用尚未明确,并在来源属性上存在极大争议。本课题拟对面神经损伤后核团胶质细胞微环境中的NG2蛋白表达和NG2阳性细胞的反应加以研究,并明确其来源属性,探讨其对受损神经元的作用,为面神经损伤后的神经元的保护提供一定的理论基础。【目的】(1)建立大鼠面神经茎乳孔处压榨、切断、抽脱模型,系统比较不同受损模式下面神经元变化的差异,为针对不同研究目的选择动物模型提供依据；(2)观测面神经离断术后不同时间点核团内NG2蛋白的表达变化,比较NG2阳性细胞与小胶质细胞、星形胶质细胞的反应差异；(3)探讨面神经离断后核团内NG2阳性细胞的来源和属性；(4)探讨面神经核团内反应性增殖的NG2阳性细胞对受损神经元的可能性作用。【方法】(1)建立大鼠面神经茎乳孔处压榨、切断、抽脱模型,按术后1天、2天、7天、14天、28天分组；(2)术后不同时间点的大鼠灌注、固定后,取包含面神经核团区的脑干部位行系统连续冰冻切片；(3)不同模型不同时间点的冰冻切片,行Cresyl Violet染色,显微镜下拍照后,观察正常侧和受损侧核团内面神经元空间形态学上的不同,并比较不同模型中受损神经元的差异；(4)行ChAT免疫组化染色,对核团区阳性神经元进行计数,并以每只动物一套切片手术侧与对照侧阳性神经元总数的比值表达活性神经元比率,进行统计学分析；(5)Western Blot法检测各组不同时间点两侧核团区的凋亡相关蛋白Caspase-3的表达,并根据扫描的密度值行半定量数据分析,得出各样本的Caspase-3/β-actin的值(均数±标准差),对各组各时间点手术侧和对照侧的值行student-t检验,P<0.05,认为有显著性差异；(6) Western Blot法检测面神经离断后核团内NG2蛋白表达,并用上述统计学方法分析其时相性变化；(7)应用免疫组化的方法,观察面神经离断术后核团区小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和NG2阳性细胞的反应,并比较其差异；(8)通过BrdU增殖实验结合免疫荧光双标染色方法,分析NG2阳性细胞的来源、属性及作用；(9)建立大鼠顶叶针刺伤异位模型,注射荧光乳胶红颗粒,术后1天、2天、7天行免疫荧光染色观察NG2阳性细胞的吞噬功能。[结果] (1)成功构建了面神经茎乳孔处压榨、切断、抽脱伤模型；早期动物行为学上均表现为完全性面瘫；随后压榨组在28天内面神经功能自行恢复,而切断组和抽脱组呈现永久性面瘫。(2) Cresyl Violet染色显示,压榨组仅在术后早期出现面神经元尼氏体的不均匀深染,切断组则表现出程度不同的凋亡前形态变化,而抽脱组在术后14天、28天时出现了凋亡神经元。(3) ChAT免疫组化染色结果表明,压榨组仅在术后7天左右出现神经元合成和释放乙酰胆碱递质能力的减弱,随后逐渐恢复；切断组和抽脱组活性神经元比率则逐步降低,与压榨组相比存在着明显的组间差异(P<0.05)。(4) Caspase-3 Western Blot结果显示,压榨组双侧核团区Caspase-3表达无明显差异,均处在较低水平,而切断组在术后7天,抽脱组在术后2天开始受损侧与正常侧相比出现高表达(P<0.05),并在28天内呈逐步增高趋势。(5)应用Western Blot方法,首次证实了面神经核团内存在NG2蛋白的表达,并发现在面神经离断术后28天内,受损侧核团内NG2蛋白呈现规律时相性变化(术后第2天起逐渐增高,7天时达峰值,随后逐渐下降,在28天左右降至基线水平)。(6)免疫组化染色结果显示,面神经离断术后小胶质细胞、星形胶质细胞和NG2阳性细胞均发生了明显的反应。NG2阳性细胞在术后2天胞体增大,突起变粗,NG2蛋白表达增强,并逐渐增殖迁移；在7天左右时对受损神经元形成了类似于小胶质细胞的紧密包绕,而这种包绕明显不同于星形胶质细胞对受损神经元所形成的疏松花环样簇拥。(7)应用免疫荧光双标染色技术发现,面神经离断后核团内的NG2阳性细胞由两种属性的细胞组成：1、核团内固有的NG2阳性细胞,这部分细胞属于传统观念上的OPC。本实验中表现为NG2+/PDGF-a-R+/OX42-或NG2+/PDGF-a-R+/Lectin-,但其对面神经离断伤无明显反应；2、诱导表达了NG2的活化小胶质细胞,这种细胞在面神经离断伤后2天逐步出现,并进一步活化增殖,细胞数目在术后7天达到峰值,并同时对受损神经元形成了紧密包绕。(8)对这种表达NG2蛋白的活化小胶质细胞的功能进行初步分析发现,NG2阳性突起伸入到受损神经元的输入或输出突触间隙之间,对Synapsin-I标示的突触末端进行了广泛的剥离。而其NG2蛋白的表达能够调节细胞的增殖、迁移和粘附。进而通过异位模型,证实这种活化的小胶质细胞并不像普通意义下激活的小胶质细胞具有吞噬能力。[结论] (1)通过对面神经茎乳孔处压榨、切断、抽脱三种损伤模型的比较研究发现,切断组核团区大量神经元功能失活,但并没有发生彻底性死亡,仅仅是发生凋亡前变化。在术后28天内进入了功能上的“休眠”状态,这与核团区的胶质细胞微环境变化存在着很大的关系。(2)研究面神经切断后胶质细胞微环境,首次发现核团区NG2蛋白的规律时相性变化,并证实其表达并非作为分泌型蛋白参与胶质瘢痕的形成,而是表达于一类特殊细胞群体表面,作为其活化的标志。(3)对反应性NG2阳性细胞来源和属性进行分析,发现面神经离断伤后出现的反应性NG2阳性细胞并非传统意义上的OPC,而是诱导表达了NG2的活化小胶质细胞,这种细胞在面神经离断伤后2天逐步出现,并进一步活化增殖迁移,对受损神经元形成了紧密包绕。(4)活化表达NG2蛋白的小胶质细胞对受损神经元进行了广泛的“突触剥离”,使之处在一个封闭的的静息状态中,从而起到了保护作用,有利于神经元功能的恢复。而这种细胞并不像普通意义下激活的小胶质细胞具有吞噬能力,其增殖、迁移和粘附能力与其NG2蛋白的表达相关。