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弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种由弓形虫感染引起的重要的人兽共患的寄生虫病。弓形虫可以感染几乎所有的温血动物(包括人),人类弓形虫的感染率达到了三分之一左右,弓形虫病传染性很强,并且流行也非常广泛。目前尚无稳定、安全、有效的弓形虫疫苗可用,因而研发高效的新型疫苗成为防控弓形虫病的首要任务。随着现代生物技术不断的创新和提高,弓形虫的基因疫苗作为可能用于预防弓形虫病的重要方式之一,其相关研究也越来越引起人们的重视。基因疫苗具有免疫保护力强、免疫持久、稳定性好、制备简单、生产成本低等诸多优点。弓形虫的致密颗粒蛋白是由颗粒细胞器分泌的一类免疫活性蛋白,它们在弓形虫的细胞内生长发育过程中起着至关重要的作用,是重要的疫苗候选分子。有关研究表明,弓形虫GRA17基因的缺失能够使虫体丧失毒力,这为我们对GRA17和GRA23基因的核酸疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗的研究奠定了基础。本研究旨在构建弓形虫GRA17基因的DNA疫苗及GRA17基因缺失株弱毒苗,评价其抗弓形虫的免疫保护力。利用RT-PCR技术从RH株弓形虫速殖子总RNA中扩增得到弓形虫TgGRA17和TgGRA23基因,构建了真核表达质粒pVAX-GRA17和pVAX-GRA23;然后将质粒瞬时转染到HEK 293-T细胞中,并对基因在细胞中的表达情况进行鉴定分析。利用重组质粒pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗组对BABL/c小鼠先后进行三次免疫,以空质粒pVAX1作为对照;在第3次免疫之后2w和每次免疫之前收集小鼠血清,利用ELISA方法对小鼠血清中的Ig G抗体水平进行检测。在第三次免疫2 w后,每组取3只小鼠,将小鼠安乐死之后取脾脏,制备脾淋巴细胞悬液;利用CCK-8法对脾淋巴细胞增殖能力进行检测,用流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞百分比。利用弓形虫速殖子抗原(STAg)刺激小鼠脾细胞,通过ELISA检测试剂盒对脾细胞因子进行检测。三次免疫之后,对小鼠进行攻虫实验,评价基因疫苗对小鼠的免疫保护力。利用CRISPR/Cas9技术在Ⅰ型RH虫株中敲除了GRA17基因,成功构建RHΔGRA17虫株,并利用RHΔGRA17虫株感染昆明小鼠,分别在免疫28 d和70 d之后收集小鼠血清,利用ELISA方法对小鼠血清中的Ig G抗体水平进行检测。并在免疫70 d之后每组取三只小鼠安乐死之后取脾脏,制备脾淋巴细胞悬液,利用弓形虫速殖子抗原刺激小鼠脾细胞,通过ELISA检测试剂盒对脾细胞因子进行检测。在免疫70 d后对小鼠进行攻虫实验,评价RHΔGRA17虫株对小鼠的免疫保护力。GRA17和GRA23基因疫苗实验结果显示,疫苗免疫组IgG抗体水平随着时间延长而逐渐升高,且混合基因疫苗组的抗体水平高于单基因疫苗组。脾淋巴细胞增殖实验与流式细胞术检测结果显示,pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23混合疫苗免疫组的SI值分别为1.24±0.13,1.54±0.11,1.57±0.085;CD4+T细胞百分比分别为21.49±1.68,21.23±3.89,20.34±1.88;CD8+T细胞百分比分别为6.66±1.02,7.63±1.24,8.20±0.97。与对照组相比以上数据都有一定程度的升高。经致死性RH株弓形虫感染后,pVAX-GRA17、pVAX-GRA23及pVAX-GRA17+pVAX-GRA23的混合疫苗组小鼠存活时间分为9.1±0.32 d、10.8±0.79 d和12.6±2.55 d,与对照组相比均有明显增长。说明pVAX-GRA17、pVAX-GRA23和pVAX-GRA17+pVAX-GRA23能够诱导小鼠产生一定水平的体液免疫和细胞免疫反应,并对弓形虫感染产生了一定程度的免疫保护力,且混合疫苗与单基因疫苗相比具有更好的免疫保护效果。RHΔGRA17虫株弱毒苗研究结果显示,RHΔGRA17弱毒虫株能够诱导机体产生相应的细胞免疫应答和体液免疫应答。弓形虫急性感染试验中,空白对照组小鼠感染弓形虫RH、PYS和TgC7虫株后,小鼠再感染10 d之内全部死亡;而经RHΔGRA17虫株免疫的小鼠能感染弓形虫RH、PYS和TgC7株速殖子后,35 d之内均无死亡现象。弓形虫慢性感染试验中,空白对照组感染弓形虫PRU株包囊后,小鼠在感染35 d后仅有40%的小鼠存活,且存活小鼠的脑包囊鼠为4296±687个/只;而经RHΔGRA17弱毒苗免疫的小鼠分别感染弓形虫PRU株包囊后,小鼠在感染35 d之内均无死亡现象,且存活小鼠的脑包囊鼠为53±15个/只。以上结果表明,RHΔGRA17虫株具有良好的免疫原性,并且能够诱导小鼠在对抗弓形虫对小鼠的急性感染和慢性感染时产生较好免疫保护力。