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肌原纤维形成调节因子1(Myofibrillogenesis regulator 1, MR-1)是一种新发现的人类功能基因。已有研究表明MR-1在实体瘤细胞和白血病细胞中高表达,MR-1下敲后的实体瘤细胞增殖减缓,迁移能力降低。因此,阐明该基因在肿瘤发生、发展和信号转导通路中的作用及其机理,将有助于肿瘤的诊断与防治。本研究的主要目的是探索MR-1基因在白血病增殖和分化中的作用机制,以及MR-1作为一个肿瘤治疗潜在靶点的可行性。研究结果如下：1.MR-1在人血液恶性肿瘤中高表达对人正常淋巴细胞以及不同人血液恶性肿瘤细胞中的MR-1 mRNA以及蛋白水平检测,结果表明MR-1基因在人淋巴细胞中几乎不表达,而在人血液恶性肿瘤细胞中高表达,尤其是在分化程度低的人红白血病细胞K562中高表达。2.MR-1表达下调引起细胞生物学行为改变RNA干扰技术主要通过外源导入与靶基因mRNA互补的双链RNA,诱导InRNA的断裂,从而抑制靶基因的蛋白表达。本研究选取MR-1表达水平最高的K562细胞,通化学合成小干扰核糖核酸(siRNA)干扰K562细胞中MR-1的表达水平,观察细胞生物学行为的变化。根据siRNA设计原理,设计并合成了2个siRNA干扰序列。转染细胞48小时后检测细胞内MR-1蛋白的表达水平及细胞的增殖水平,选择抑制效果最好的序列,进行后续研究工作。生长曲线法进一步检测MR-1-siRNA对K562细胞增殖速率的影响。结果显示,经MR-1-siRNA处理后,K562细胞生长速度明显减慢,增殖抑制率约为50%。经三次转染后,K562细胞的巨核细胞表面标志CD41表达轻微升高。3. K562/MR-1-细胞系的生物学行为改变首先构建了可以稳定表达MR-1-shRNA的pCD-sh-MR-1载体,并将它稳定转染K562细胞,进行单克隆培养筛选出4株稳定表达MR-1-shRNA的细胞系K562/MR-1-作为对照,建立了K562/Mock细胞系。对K562/MR-1-细胞系的生物学功能进行检测,结果显示四株稳定细胞的CD41表达率分别为6.7%,4.8%,1.3%和1.4%,对照为0.3%；细胞增殖速率和克隆形成率均为对照的40%-50%；G0/G1期延长,且G0/G1期的周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21表达增加, Rb的磷酸化水平下降。形态学观察发现,K562/MR-1-细胞中出现了向巨核细胞分化的生理特征。与对照组相较,K562/MR-1-细胞体积增大,部分细胞的直径达到对照组的3-4倍,约601μm左右,且在这些大细胞中出现了空泡；瑞士—吉姆萨染色观察到细胞核增大,核浆比增加；Hochest染色观察到出现了8N,16N,32N以及64N的多倍体细胞以及细胞凋亡的现象；多倍体定量分析发现,K562/MR-1-细胞的多倍体含量约为对照组的3倍左右；凋亡双染检测显示,K562/MR-1-细胞的凋亡率是对照的2-4倍。促巨核细胞分化剂PMA对细胞作用后,可促进K562细胞向巨核细胞分化。同样,PMA处理的K562/MR-1-细胞粘附性增加,空泡细胞增多,CD41抗原表达量是对照的1.5-2倍左右,细胞增殖能力进一步降低。4.K562/MR-1+细胞的生物学行为改变采用能在真核细胞中高效表达目的基因的质粒pcDNA3.1+,我们构建了MR-1高表达质粒pcDNA3.1-MR-1将pcDNA3.1-MR-.1稳定转染入K562细胞中,经过单克隆挑选,建立K562/MR-1+细胞系,Western blot法检测,证明该细胞系中MR-1蛋白的表达水平显著增加。同时稳定转染pcDNA3.1+,建立K562/EV细胞系。生长曲线以及克隆形成检测K562/MR-1+细胞的增殖速率,结果显示K562/MR-1+细胞的增殖速率和克隆形成率均较空载体组增加,二者都增加40%左右。5.MR-1在白血病细胞增殖和分化中的作用机制研究证实,MAPK通路在促进巨核细胞分化过程中起到核心关键的作用,且MAPK通路的磷酸化程度与细胞的巨核分化程度程正比关系,而MAPK激活的强度和持续时间在决定造血细胞运阶段起到很重要的作用,瞬时或者短暂激活MAPK可以很明显地促进细胞周期的进程并促进增殖,持续的MAPK激活则可引起细胞周期阻滞和分化。在这个信号通路中,ERK2的磷酸化显得尤其重要。与对照组相比,MR-1下敲细胞的MAPK通路被强烈激活,其成员Raf、MEK、ERK2以及下游的RSK和MSK的磷酸化程度显著增强,RSK和MSK的磷酸化可促进一些促巨核细胞分化基因的转录,引起细胞的分化。为了进一步确定是否是ERK的磷酸化引起K562/MR-1-细胞向巨核细胞分化,我们采用ERK的磷酸化抑制剂处理细胞,结果表明MR-1下敲细胞的分化降低,增殖速度回复。综上所述,MR-1基因可能与抑制白血病K562细胞向巨核细胞系分化相关,其作用机制是通过抑制Raf-MEK-ERK信号通路,抑制细胞分化并促进肿瘤细胞的增殖实现的。下敲MR-1可以抑制白血病细胞的增殖和促进白血病细胞的分化,因此MR-1有可能成为潜在的白血病治疗新靶点。