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背景和目的近年来,宫颈癌的发病率、死亡率、淋巴结受累率、远处转移率和复发率仍较高。宫颈腺癌的发病率、耐药率、复发率、卵巢、盆腔淋巴结和远处转移率仍居高不下,并且与鳞状细胞癌相比,预后更差。因此,深入研究低毒且高敏感性的治疗药物及其作用机制,制定更有效的治疗策略仍是当前宫颈癌防治工作的重中之重。本研究旨在探索6-甲氧基黄酮诱导He La细胞S期阻滞和凋亡的分子机制及其疗效评估的关键基因。方法1.中药小分子化合物筛选及实验验证:基于网络药理学和生物信息学大数据筛选技术,对13729个化合物进行筛选;体内外实验验证6-甲氧基黄酮的抗肿瘤活性;转录组测序分析6-甲氧基黄酮的生物功能和作用机制。2.6-甲氧基黄酮通过CCNA2/CDK2/p21CIP1通路诱导He La细胞S期阻滞:基因集富集分析筛选主成分的生物功能;流式细胞术检测细胞周期;q PCR和Western blot检测6-甲氧基黄酮干预后细胞周期调控网络相关基因的m RNA和蛋白表达水平;分子对接分析配体和受体的亲和力;CDK2功能获得实验和裸鼠移植瘤实验研究细胞周期通路中的关键基因CDK2的作用机制;使用来源于TCGA数据库的患者资料进行临床特征分析。3.6-甲氧基黄酮通过p-PERK/p-EIF2α/ATF4/CHOP通路诱导He La细胞凋亡:Hoechst33342染色和流式细胞术检测He La细胞凋亡率;透射电子显微镜观察亚细胞结构;q PCR和Western blot检测6-甲氧基黄酮干预后细胞凋亡通路相关基因的m RNA和蛋白表达水平;分子对接筛选细胞凋亡通路中的关键基因;EIF2AK3/PERK的功能获得和功能丧失实验、磷酸化抑制剂实验、流式细胞术凋亡检测实验、免疫共沉淀实验和裸鼠移植瘤实验明确关键基因EIF2AK3/PERK的作用机制;使用来源于TCGA数据库的患者资料进行临床特征分析。结果1.基于网络药理学大数据筛选技术,获得13729个小分子化合物。通过药代动力学、靶基因、差异表达和功能富集筛选,得到了1个小分子化合物,即6-甲氧基黄酮。Pharm Mapper数据库178个靶标功能富集分析发现,6-甲氧基黄酮与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和蛋白磷酸化过程显著相关。CCK-8检测发现,6-甲氧基黄酮显著抑制He La细胞增殖。裸鼠移植瘤实验发现,6-甲氧基黄酮显著抑制裸鼠皮下移植瘤生长。转录组测序后功能富集分析发现,6-甲氧基黄酮与细胞增殖、周期、凋亡、内质网应激和蛋白质修饰过程显著相关。2.主成分分析联合差异表达分析筛选得到两个靶标:CDK2和CCNA2。流式细胞术细胞周期检测显示,6-甲氧基黄酮显著诱导He La细胞S期阻滞。q PCR和Western blot分析显示,6-甲氧基黄酮显著下调He La细胞中CDK2和CCNA2的m RNA和蛋白表达水平,显著上调p21CIP1的表达水平,与转录组测序结果一致。分子对接显示,6-甲氧基黄酮对CDK2的亲和力最强。6-甲氧基黄酮与CCNA2和CDK2的非共价相互作用主要为18个疏水相互作用、3个盐桥和3个氢键。Western blot分析显示,CDK2的功能获得可逆转6-甲氧基黄酮干预后引起的CDK2低表达。体内实验显示,6-甲氧基黄酮显著下调CDK2的蛋白表达水平。因此,6-甲氧基黄酮通过CCNA2/CDK2/p21CIP1信号通路诱导He La细胞S期阻滞。此外,临床分析显示,CCNA2、CDK2和p21CIP1的m RNA表达水平与药物敏感性显著相关;CDK2的m RNA表达水平与宫颈癌患者的组织学分类显著相关;p21CIP1的m RNA表达水平与宫颈癌患者的FIGO分期显著相关。3.Hoechst33342染色、流式细胞术和透射电子显微镜观察表明,6-甲氧基黄酮显著诱导He La细胞凋亡。q PCR和Western blot分析表明,6-甲氧基黄酮显著上调He La细胞中EIF2S1/EIF2α、ATF4和DDIT3/CHOP的m RNA和蛋白表达水平,显著下调EIF2AK3/PERK的m RNA和蛋白表达水平,显著上调p-PERK和p-EIF2α的蛋白表达水平,与转录组测序结果一致。分子对接表明,6-甲氧基黄酮对EIF2AK3/PERK的亲和力最强。6-甲氧基黄酮与PERK、ATF4和CHOP之间的非共价相互作用包括:17个疏水相互作用、1个π-阳离子相互作用、1个π-堆积和1个氢键。流式细胞术和Western blot分析表明,EIF2AK3/PERK的功能获得实验和GSK2656157显著改变了6-甲氧基黄酮诱导的He La细胞凋亡水平,显著改变了p-PERK的蛋白表达水平。体内实验表明,6-甲氧基黄酮显著上调p-PERK和p-EIF2α的蛋白表达水平。免疫共沉淀实验表明,p-PERK和p-EIF2α之间存在相互作用。因此,6-甲氧基黄酮通过p-PERK/p-EIF2α/ATF4/CHOP通路诱导He La细胞凋亡。此外,临床特征分析表明,EIF2AK3/PERK和EIF2S1/EIF2α的m RNA表达水平与宫颈癌患者的组织学分类显著相关,DDIT3/CHOP的m RNA表达水平与FIGO分期显著相关。结论1.6-甲氧基黄酮抑制宫颈癌细胞增殖。2.6-甲氧基黄酮通过CCNA2/CDK2/p21CIP1通路诱导He La细胞S期阻滞。3.6-甲氧基黄酮通过p-PERK/p-EIF2α/ATF4/CHOP通路诱导He La细胞凋亡。4.CDK2是CCNA2/CDK2/p21CIP1通路的关键基因,CDK2的功能获得显著上调CDK2和CCNA2的表达水平,逆转6-甲氧基黄酮干预后引起的CDK2低表达。5.p-PERK是p-PERK/p-EIF2α/ATF4/CHOP通路的关键因子,EIF2AK3/PERK过表达和GSK2656157显著改变PERK的磷酸化水平,显著改变6-甲氧基黄酮诱导的He La细胞凋亡水平。6.6-甲氧基黄酮抑制裸鼠皮下移植瘤生长。