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研究目的:血管性痴呆是由多种脑血管疾病所引发的认知功能障碍综合征。作为一种慢性进行性疾病,近年来我国血管性痴呆发病率逐年攀升,目前血管性痴呆疾病仍缺乏预防及长期有效的治疗措施,研究表明四物汤对于血管性痴呆具有一定程度的治疗作用,可以改善血管性痴呆大鼠的认知功能障碍,但对于这种保护机制的研究还不够充分。血管性痴呆会导致学习记忆能力的下降,引发认知功能障碍,影响突触相关蛋白的表达。本研究首先建立有效的血管性痴呆大鼠模型,并且利用小极性石油醚溶剂提取四物汤石油醚部位。通过体内体外实验共同探讨该部位对于血管性痴呆疾病的治疗作用。MicroRNAs(miRNAs)作为一种与大脑发育和功能密切相关的内源性非编码小RNA,在各种脑血管疾病中均发挥着不可替代的作用。通过芯片分析筛选特异性表达的miRNAs,探究四物汤石油醚部位是否通过调控miRNAs治疗血管性痴呆。我们进一步采用行为学实验探讨miR-134-5p对于血管性痴呆大鼠认知功能障碍的调控作用。明确了 miR-134-5p与Foxp2的直接靶向作用;探讨了 miR-134-5p/Foxp2/Synl调控血管性痴呆大鼠认知功能变化。探究四物汤石油醚部位与miRNAs联用或者单用对于血管性痴呆的影响。研究方法:1.提取四物汤石油醚部位,选用220～250g SD雄性大鼠,通过2V0法永久结扎双侧颈总动脉的方法制备血管性痴呆大鼠模型,随机分为空白对照组,VD模型组,四物汤石油醚部位高剂量组,四物汤石油醚部位低剂量组。给药后进行水迷宫实验。之后取大脑皮质进行miRNA基因芯片分析。取材新鲜皮质和海马组织,采用RT-qPCR实验检测miR-134-5p在血管性痴呆大鼠模型皮质和海马组织中的表达情况。2.选用220～250g SD雄性大鼠,通过2V0法永久结扎双侧颈总动脉的方法制备血管性痴呆大鼠模型,随机分为空白对照组,VD模型组,miR-134-5p拮抗剂组。侧脑室注射拮抗剂后进行水迷宫实验。采用RT-qPCR实验与Western Blot实验检测各组大鼠皮质组织中与认知功能障碍相关的突触相关蛋白表达情况。3.提取四物汤石油醚部位,无血清刺激的同时分别将不同浓度药物加入PC12细胞,采用RT-qPCR实验检测miR-134-5p在四物汤石油醚部位的作用下的表达情况,体外实验验证药物是否影响miR-134-5p的表达。4.综合利用多个生物信息学网站预测并筛选miR-134-5p靶基因。构建rno-miR-134-5p的模拟物和抑制物以及各组阴性对照分别转染至PC12细胞,采用Western Blot实验检测靶基因Foxp2蛋白的表达情况;构建包含Foxp2-3’ UTR与rno-miR-134-5p结合位点的双荧光素酶报告载体,联合miR-134-5p模拟物抑制物及其阴性对照共同转染至PC12细胞,进一步验证Foxp2与miR-134-5p之间的靶向关系。5.转染rno-miR-134-5p的模拟物和抑制物及其各自阴性对照至PC12细胞,采用Western Blot实验检测突触相关蛋白表达水平。构建Foxp2的siRNA片段转染至PC12细胞,沉默Foxp2,采用Western Blot实验检测突触相关蛋白表达水平变化。之后进行ChIP实验,验证Foxp2与其下游靶基因Synl的靶向关系。研究结果:1.本实验采用双侧颈总动脉永久结扎(2V0)方法建立血管性痴呆大鼠模型,动物腹腔注射四物汤石油醚部位。GC-MS实验分析了四物汤石油醚部位的主要化学成分;miRNA基因芯片结果表明,与VD模型组相比,四物汤石油醚部位高剂量组大鼠皮质中有56个miRNA表达显著下降(PP<0.05),初步验证四物汤石油醚部位对于miR-134-5p具有靶向作用;Morris水迷宫实验结果表明,四物汤石油醚部位可以改善血管性痴呆大鼠的认知功能障碍;与空白对照组相比,VD模型组大鼠产生明显认知功能障碍,逃避潜伏期延长(P<0.001),穿越平台次数减少(P<0.001),证明血管性痴呆大鼠模型建立成功;与VD模型组相比,四物汤石油醚部位高剂量组与低剂量组大鼠的逃避潜伏期均缩短(P<0.001),穿越平台次数均增加(P<0.05)。2.采用双侧颈总动脉永久结扎(2V0)方法建立血管性痴呆大鼠模型,连续三天侧脑室注射miR-134-5p拮抗剂。miRNA基因芯片结果表明,与空白对照组相比,VD模型组大鼠皮质中有46个miRNA表达显著升高(P<0.05);Morris水迷宫实验结果显示,抑制miR-134-5p的表达可以改善血管性痴呆大鼠的认知功能障碍;与空白对照组相比,VD模型组大鼠产生明显认知功能障碍,逃避潜伏期延长(P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.001),证明血管性痴呆大鼠模型建立成功;与VD模型组相比,miR-134-5p拮抗剂逃避潜伏期缩短(P<0.01),穿越平台次数增加(P<0.05)。3.Western Blot实验结果显示,与空白对照组对比,VD模型组大鼠皮质中Foxp2以及突触相关蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组对比,miR-134-5p拮抗剂组Foxp2与突触相关蛋白表达显著升高(PP<O.001)。4.双荧光素酶报告基因结果显示,共同转染miR-134-5p和pLUC-Foxp2之后,miR-134-5p mimic 降低了 pLUC-Foxp2 的荧光素酶活性(P<0.001),而 miR-134-5p inhibitor升高了 pLUC-Foxp2的荧光素酶活性(P<0.001),初步验证了 miR-134-5p与Foxp2之间的靶向性。Western Blot实验结果显示,与各自阴性对照组比较,miR-134-5p mimic转染组Foxp2表达降低(P<0.01),miR-134-5p inhibitor 转染组 Foxp2 表达升高(P<0.05)。5.Western Blot结果表明,miR-134-5p mimic转染组抑制突触相关蛋白表达(P<0.05),miR-134-5p inhibitor转染组突触相关蛋白表达增加(P<0.05)。沉默Foxp2之后,突触相关蛋白表达也被抑制(P<0.01)。ChIP实验验证,Foxp2作为转录因子,与Syn1启动子区域特异性结合,Syn1可能为其下游靶点之。结论:1.四物汤石油醚部位对于血管性痴呆大鼠的认知功能障碍具有一定程度的改善作用,并且对于在血管性痴呆大鼠皮质组织中特异性表达的miR-134-5p具有靶向作用。2.miR-134-5p低表达对于血管性痴呆大鼠的认知功能障碍具有一定程度的改善作用,并且影响突触相关蛋白的表达。3.Foxp2为miR-134-5p下游靶基因之一。4.miR-134-5p/Foxp2/Syn1通路可能参与血管性痴呆的治疗。