论文部分内容阅读
目的通过观察清道夫受体(Scavenger receptor class B type I, SR-BI)基因敲除小鼠脾脏组织中含铁血黄素的沉积的变化;比较氮基三醋酸铁(ferric nitrilotriacetate, Fe-NTA)诱导的细胞毒性对HepG2(-)细胞SR-BI蛋白表达水平的影响；研究SR-BI蛋白的表达对Fe-NTA、血红蛋白(hemoglobin)或高铁血红素(hemin)等高价铁(Fe3+)诱导的细胞毒性的影响以及探讨Fe-NTA诱导细胞毒性的发生机制,为SR-BI可以抑制Fe-NTA、Fe-NTA-H2O2、hemoglobin-H2O2和hemin-H2O2等高价铁(Fe3+)所诱导的细胞毒性提供一定的理论和实验依据,为SR-BI功能研究提供新的关注点。方法1.SR-BI杂合子(SR-BI+/-)小鼠交配繁殖,筛选SR-BI正常和SR-BI基因敲除小鼠,8-12周龄小鼠麻醉处死,分离摘取脾脏组织,常规组织切片、HE染色和普鲁士蓝染色,显微镜下观察比较两组小鼠脾脏组织结构、脾脏红髓中含铁血黄素(haemosiderin)沉积量的变化。2.采用蛋白质印迹(Western blot)技术检测不同浓度Fe-NTA培养的人肝癌HepG2(-)细胞中SR-BI蛋白表达的变化；利用细胞转染技术将human-SR-BI-cDNA转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,筛选建立CHO-SR-BI和CHO-Vector细胞株。选取2-3代的培养细胞,分别单独给予浓度都为0、0.2、0.4、0.8、1.0mM的Fe-NTA、H2O2,浓度为0、0.8、1.0、2.0mM的NTA,显微镜下观察细胞生长状态的变化,检测细胞培养基中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的含量,探讨SR-BI蛋白的表达对Fe-NTA诱导的细胞毒性的影响以及NTA、H2O2对细胞生长的影响。3.选取2-3代培养的CHO-SR-BI细胞和CHO-Vector细胞,分别给予0.2mM Fe-NTA培养24小时和0.05mM Fe-NTA培养48小时,显微镜下观察细胞生长状态变化,提取细胞DNA,利用琼脂糖凝胶电泳DNA鉴定技术,检测有无DNA梯状条带的形成,探讨Fe-NTA诱导的细胞毒性的发生机制；分别给予浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.0mM的Fe-NTA-H2O2,浓度为0、6.25、12.5、25.0uM血红蛋白-H2O2、高铁血红素-H2O2,显微镜下观察细胞生长状态的变化,检测CHO-SR-BI细胞和CHO-Vector细胞的培养基中LDH的含量,比较SR-BI蛋白的表达对上述各种含高价铁(Fe3+)混合物所诱导的细胞毒性的影响。结果1.HE染色和普鲁士蓝染色：与SR-BI正常小鼠相比,SR-BI基因敲除小鼠脾脏红髓、白髓分布不规律,红白髓界限不清,白髓大小不一,尤其是红髓区域内出现大量含铁血黄素的沉积(p<0.05)2.在本实验条件下,实验结果表明Fe-NTA可以诱导细胞出现非凋亡性的损伤和死亡；蛋白印迹技术检测结果显示Fe-NTA诱导的细胞毒性对HepG2(-)细胞中SR-BI蛋白表达水平没有明显影响(p>0.05)。3.H2O2对于Fe-NTA诱导的细胞毒性有明显的增强作用(p<0.05)；给予不同浓度的Fe-NTA、Fe-NTA-H2O2、血红蛋白-H2O2及高铁血红素-H2O2培养后,CHO-SR-BI细胞培养基中LDH释放百分比例显著低于CHO-Vector细胞组,两组的差异具有统计学意义(p<0.05),说明细胞中SR-BI蛋白的表达可以明显抑制Fe-NTA、Fe-NTA-H2O2、血红蛋白-H2O2、高铁血红素-H2O2等含高价铁(Fe3+)的混合物所诱导的细胞毒性。。结论1.SR-BI基因敲除小鼠脾脏红髓、白髓分布不规律,红白髓界限不清,白髓大小不一,尤其是红髓区域内出现大量含铁血黄素的沉积。2. Fe-NTA诱导浓度依赖性的细胞毒性,并导致细胞出现非凋亡性的损伤和死亡,而Fe-NTA对HepG2(-)细胞中SR-BI蛋白的表达并没有明显影响。3.H2O2明显增强Fe-NTA诱导的细胞毒性；SR-BI不仅明显抑制Fe-NTA诱导的细胞毒性,而且显著抑制Fe-NTA-H2O2、血红蛋白-H2O2、高铁血红素-H2O2等含高价铁(Fe3+)的混合物所诱导的细胞毒性。