研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的发病率在肾脏肿瘤中占90-95%,约占成人恶性肿瘤的2-3%,且发病率和死亡率逐年增加。RCC起病隐匿,患者早期常无明显临床症状,容易被忽视。除此之外,RCC具有侵袭性,且治疗相对单一,以手术切除为主,放疗、化疗、免疫治疗等其他辅助治疗效果欠佳。这些都是造成晚期肾癌预后差、死亡率高的原因。RCC有多种不同的病理分型,不同分型肿瘤的遗传学、生物学行为也不尽相同。其中,肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)约占70%,是最常见的病理类型。在最近的几年中,对RCC发生、发展的生物学机制的研究主要集中在基因突变,蛋白质编码的基因表达异常和表观遗传变异等。然而,随着研究的深入,人们发现,一种非蛋白编码的RNA, microRNA的异常调节与RCC密切相关。microRNA表达的研究对明确RCC的发病机理,早期诊断,提高预后具有重大意义。microRNA (miRNA)是一种只有19-25个核苷酸的短链非编码RNA,其介导转录后基因表达的调节。成熟的miRNA与目标信使RNA (messenger ribonucleic acid, mRNA)结合,形成沉默复合体,从而沉默mRNA,导致其降解或抑制翻译。通过这种负向调节作用,这种小RNA,实现了包括细胞生长、分化、增殖、凋亡和细胞周期调控等多种广泛的生物学功能调节。此外,miRNA表达与肿瘤的关系亦非常密切。大量研究表明,miRNA在多种人类恶性肿瘤中表达异常,是恶性肿瘤的重要调节因子,在肿瘤的发生、发展、逃避凋亡,血管生成及组织浸润和转移中起非常重要的作用。miRNA在不同的肿瘤中可起到癌基因或抑癌基因样作用。此前的文献已报道了RCC中异常miRNA的表达谱,这些异常表达的miRNA可以促进细胞增殖,影响细胞侵袭,抑制细胞凋亡,最终导致RCC的发生和发展。除此之外,敲除过表达的miRNA或者重新表达在癌细胞中沉默的miRNA可导致肿瘤细胞的死亡。因此,我们可预计,miRNA会成为肿瘤治疗的新靶点。miR-155由B细胞整合簇(B-cell integration cluster, BIC)基因编码。研究表明,miR-155在造血细胞生成、炎症反应、免疫反应及肿瘤的发生和发展中发挥重要效应。miR-155的癌基因样作用在造血系统恶性肿瘤中首次被发现,miR-155在B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病表达升高。miR-155在许多实体恶性肿瘤中也高表达,如乳腺癌,肺癌,结肠癌,胰腺癌和甲状腺癌等。利用基因芯片对RCC及正常肾组织分析表明,共有35种miRNA在RCC中表达显著异常,其中miR-155在RCC中表达显著升高,但其详细机制尚不明确。磷脂酰肌醇三激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)信号通路是调节众多生物学进程的经典通路。如：细胞增殖,凋亡,转移,基因转录,核糖体功能等等。PI3K/AKT与各种恶性肿瘤,包括RCC的发生、发展关系密切。P13K可被多种细胞因子激活,随后通过过AKT的磷酸化,而发挥功能,从而引起细胞增殖,凋亡抑制和细胞迁徙。抑制PI3K/AKT通路可诱导肿瘤细胞的程序性凋亡和生长抑制。最近,有文献表明,在RCC中,miR-155有可能作为上游调节因子,作用于PI3K,从而激活PI3K/AKT信号通路。但其具体机制尚不清楚。FOXO3a是AKT的下游靶基因之一,它是具有叉头样结构的转录因子家族的成员之一。FOXO3a在正常情况下分布于细胞核内,其可以上调细胞凋亡调节蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 interacting mediator of cell death, BIM)和Fas,从而在细胞凋亡过程中起非常关键的作用。除此之外,FOXO3s还可通过激活下游组件,如生长抑制及DNA损伤诱导基因(growth arrest and DNA damage-inducible genes, GADD45A),引起细胞G2/M期生长阻滞。FOXO3a是一种非常重要的肿瘤抑制因子。综上所述,我们有理由推断miR-155在RCC的发生、发展中发挥重要的作用。其调节机制是通过激活PI3K/AKT路径,引起FOXO3a表达异常而实现。在本次研究中,我们将证实miR-155在RCC中,是引起细胞增殖和侵袭的重要决定因素,且它的作用是通过介导PI3K/AKT/FOX03a信号通路实现的。第一章miR-155在人肾细胞癌中表达的临床意义研究目的(1)研究miR-155在人肾细胞癌组织中及肾癌细胞系中的表达情况。(2)观察miR-155与RCC的国际泌尿病理学会(ISUP)分级、TNM分期之间的关系。材料与方法1.组织样本：收集滨州医学院附属医院收治的20例行肾癌根治术的RCC患者新鲜肿瘤组织及周边正常肾组织,-80℃低温保存。并且记录患者就诊时临床资料、TNM临床分期、病理标本检查资料、治疗情况及其存活状况。所有患者术前均未行任何放疗、化疗及其他治疗。本次研究的病人均签署知情同意书,所有研究内容均经过滨州医学附属医院伦理委员会审批。2.组织病理学诊断和TNM分期：所有病例均经过病理诊断确诊。采用双盲法,请2位高年资病理学医师对所有病例按照2012年国际泌尿病理学会(ISUP)肾脏肿瘤组织学分级进行形态学复习并分级。根据病例资料,按照美国癌症联合委员会(AJCC)标准进行TNM分期。3.细胞培养：人肾细胞癌细胞系ACHN、CAKI-1、786-0购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。人肾小管上皮细胞系HK-2,购自由美国ATC C公司。在37℃恒温,5%CO2含量的培养箱中,用包含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。4.RNA提取及实时定量RT-PCR：应用实时定量RT-PCR技术检测新鲜组织及RCC细胞系中miR-155的表达。应用TRIzol试剂盒提取组织和细胞中总RNA,用miRNA检测试剂盒进行逆转录。PCR反应在ABI 7500 Real-Time PCR系统中反应完成。具体步骤为：95℃,10分钟1周期；95℃,15秒；然后60℃,1分钟,40周期。每一样本进行一式三份实验,计算取平均值,应用U6作为内参。5.统计学分析：数据以x±SD表示,使用SPSS17.0软件对数据进行方差分析,|根据统计学要求,P<0.05,认为差异有统计学意义。实验结果1.本实验共收集20例RCC患者新鲜肿瘤组织及配对非肿瘤组织标本。其中男性12例,女性8例。年龄34～73岁,平均66岁。病理类型均为肾透明细胞癌。按照ISUP病理分级：1级6例,2级7例,3级4例,4级3例。TNM分期：Ⅰ期：10例,Ⅱ期：7例,Ⅲ期3例,Ⅳ期0例。所有患者术前均通过影像学检查未发现远处转移。术前均未行任何放疗、化疗及其他治疗。2.miR-155在RCC组织中表达显著上调,较癌旁正常肾组织相比平均增加5.6倍。结果有显著统计学意义(P<0.05)。3.miR-155在RCC各细胞系中表达显著上调。与人类肾小管上皮细胞株HK-2相比,miR-155在ACHN、CAKI-1与786-0细胞系中表达均上调,结果有显著统计学意义(P<0.05)。4.miR-155在RCC不同病理分级的表达情况：根据病理分级进行分组,ISUP分级1～2级中miR-155的相对表达量为0.044±0.024,ISUP分级3-4级为0.102±0.034,有显著统计学差异(P<0.05)。5.在不同TNM分期组合样本中,Ⅰ期miR-155的相对含量为0.043±0.026,Ⅱ-Ⅲ期为0.085±0.039,有显著统计学差异(P<0.05)。实验结论1.在RCC新鲜组织及细胞系中,miR-155表达较癌旁正常肾组织或HK-2细胞系明显上调,提示miR-155可能在RCC的发病原因中起原癌基因样作用。2.不同ISUP分级的RCC中,miR-155表达存在差异。ISUP分级升高,miR-155表达也相应升高。3.不同TNM分期的RCC中,miR-155表达存在差异。TNM分期越高,miR-155的表达也相应升高。第二章miR-155及PI3K/AKT/FOXO3a通路与肾癌细胞生物学行为的关系研究目的(1)探讨miR-155表达的变化对肾癌细胞增值、凋亡、侵袭能力等生物学行为的影响。(2)探讨miR-155及PI3K/AKT/FOXO3a通路在调节肾癌细胞生物学行为中的作用。材料与方法1.转染miR-155抑制剂于肾癌细胞系：选取ACHN细胞系作为模型,随机分为3组,(1)miR-155 inhibitor组：使用Lipofectamine 2000方法将miR-155hairpin inhibitor转染至ACHN细胞系；(2)Negative control组：将miR-CON转染至细胞系；(3) Untreated组：正常未经转染的ACHN细胞。用实时定量RT-PCR检测转染效果。2.细胞增殖分析：ACHN细胞(3×104 cells/well),在96孔板中培养过夜,用上述方法进行转染,分别在转染后24h、48h和72h,用MTT法检测细胞的增值。样本的吸光度用微孔板分光光度计在490nnm检测,该实验重复3次。3.克隆形成实验：ACHN细胞被转染后,置入6孔板中,细胞密度为1000cells/well。在37℃培养10天后,将细胞洗涤,福尔马林固定,然后用结晶紫进行染色。用显微镜进行观察,超过50个细胞的克隆数为阳性,每组样本一式三份。4.细胞周期分析：将ACHN细胞置入6孔板中,过夜,用上述方法转染后,孵化48h,用流式细胞仪确定细胞周期分布。该实验重复3次。5.凋亡分析：将ACHN细胞置入6孔板中,过夜,转染后,孵化48h,收集细胞,用冰PBS洗2次,总量1.0×105细胞在100μLPBS中重悬,然后在常温避光下,与5μL FITC标记的膜联蛋白和5μL碘化丙啶混合15分钟,然后加入400μL缓冲液,应用流式细胞仪进行凋亡分析。6.细胞划痕实验(Wound-healing assay):将ACHN细胞置入6孔板中,过夜,转染后,孵化48h,用200μL枪头做横线划痕,用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基。在常规条件下培养48h,用显微镜在划痕的相同部位拍照。7.细胞侵袭实验(Transwell assay):ACHN细胞转染,孵化48h后,取200μL约含5×104细胞的培养液种于上室,下室用培养基填满,孵育12h后,将包含细胞的膜用多聚甲醛固定,结晶紫染色,将膜的底面放大100倍拍照,每个小室随机选取5个区域拍照。8.Western bolt实验：应用Western bolt检测ACHN细胞系中PI3K(P110α)、p-AKT(Ser473)、FOX03a蛋白的表达。细胞裂解以后,进行凝胶电泳,转膜,封闭,分别孵一抗和二抗,然后显影。应用GAPDH作内参。9.统计学分析：数据以x±SD表示,使用SPSS17.0软件对数据进行方差分析,根据统计学要求,P<0.05,认为差异有统计学意义。实验结果1.转染miR-155抑制剂于ACHN细胞株后,MTT法检测细胞增殖明显减弱(P<0.05),克隆形成实验也表明,培养10天后,克隆形成较Negative control组和Untreated组明显减少(P<0.05)。2.下调miR-155表达后,ACHN细胞的凋亡增加,并出现细胞周期阻滞。流式细胞仪分析显示：转染miR-155抑制剂使细胞凋亡率显著增加(P<0.05),这一结果表明,抑制miR-155表达,可以促进细胞凋亡。而且,抑制miR-155的表达,减少了处于S期的细胞比率,增加了处于G1/G0期细胞比率,使得细胞发生G1/G0期阻滞,减弱了细胞增殖。3.抑制miR-155的表达使得细胞迁徙和侵袭能力下降。Wound-healing assay实验和T ranswell实验均表明：抑制miR-155的表达使得细胞迁徙和侵袭能力下降(P<0.05)。4.抑制miR-155的表达使得PI3K(P110α)和p-AKT (Ser473)的表达降低。Western bolt实验表明,抑制miR-155的表达引起了PI3K(P110α)和p-AKT(Ser473)表达的降低(P<0.05)。这表明,miR-155通过上调PI3K-AKT路径而实现其癌基因样的作用。5.抑制miR-155的表达使得FOXO3a的表达升高。Western bolt实验表明,抑制miR-155的表达引起了约2倍的FOX03a表达的升高(P<0.05)。这表明,miR-155通过PI3K-AKT通路负向调节FOXO3a而实现其癌基因样的作用。实验结论1.通过转染,敲低miR-155表达可以使得ACHN细胞增殖减少,凋亡增加,侵袭能力下降,并且出现细胞周期阻滞。提示miR-155可能在RCC的进展,转移中起促进作用。2.抑制miR-155表达可以使得PI3K (P110α)和p-AKT(Ser473)表达的降低,FOXO3a的表达升高。表明：miR-155通过PI3K-AKT通路负向调节FOXO3a的表达,从而影响RCC的进展。