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第一部分细胞自噬在老年和青年炎症性肠病中的作用机制研究目的:通过临床标本和动物模型两方面,从细胞自噬角度,探究老年和青年炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)发病机制的异同。方法:1.收集老年和青年健康人、老年和青年溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC))患者的肠粘膜组织(共四组,各10例)。2.雄性C57BL/6青年(6-8周)和老年(56周)小鼠,各分为对照组和实验组(共4组,每组6-10只),实验组予葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)饮用水、对照组予自由饮用水7天,第8天处死。3.雄性C57BL/6老年小鼠(56周)分为对照组、实验组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)干预组(每组5-7只)。对照组和实验组处理方式同前,3-MA干预组在给予DSS饮用水同时,给予3-MA 10mg/kg/d腹腔注射7天。4.电镜观察结肠组织自噬体结构;应用蛋白电泳、免疫组化染色法检测小鼠结肠组织自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、p62、ATG5、Beclinl,巨噬细胞标志物F4/80蛋白表达量;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠结肠组织的促炎因子TNF-α、IL-6,趋化因子CCL4、CXCL12,M1型巨噬细胞表面标志物CD86 mRNA相对表达量。非放射性凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测NF-κB 转录活性。结果:1.临床标本:电镜观察可见老年和青年UC患者结肠上皮细胞内自噬体结构,而老年和青年对照组均未见上述结构。与对照组比较,老年和青年UC患者结肠上皮细胞ATG5染色较深,结肠组织LC3B-Ⅱ表达较高,p62表达较低。与青年UCC比较,老年UC患者结肠组织LC3B-Ⅱ表达较高,p62表达较低。2.动物实验—小鼠结肠炎2.1与青年实验组比较,老年实验组小鼠体重下降较快、DAI升高较快、病理表现较重,结肠组织F4/80染色细胞数量较多,炎症因子IL-6及趋化因子CCL4、CXCL12表达增加。2.2电镜可见老年和青年DSS小鼠结肠上皮细胞内自噬体结构,而对照组未见上述结构。与对照组比较,老年和青年DSS小鼠结肠上皮细胞Beclinl和ATG5染色较深,结肠组织LC3B-Ⅱ表达量较高,p62表达量较低。与青年DSS小鼠比较,老年DSS小鼠结肠组织LC3B-Ⅱ表达量较高,p62表达量较低。3.动物实验—3-MA干预3.1与实验组比较,3-MA干预组小鼠结肠上皮细胞Beclinl、ATG5染色细胞数量少、染色较浅,结肠组织LC3B-Ⅱ表达较低、p62表达较高。与实验组比较,3-MA干预组小鼠结肠炎症状较轻,表现在体重下降较慢、DAI升高较慢、病理表现较轻。3.2与实验组比较,3-MA干预组结肠组织趋化因子CCL4、CXCL12和炎症因子TNF-α、IL-6mRNA相对表达较低,结肠组织F4/80染色细胞数量较少,结肠组织CD86 mRNA相对表达量较低,EMSA检测结肠组织核蛋白NF-kB转录活性减低。结论:1.老年和青年UC患者结肠上皮细胞内均发生自噬现象,且老年患者自噬活性增强程度较高。2.衰老加重了 DSS小鼠结肠炎症状。老年和青年DSS小鼠结肠上皮细胞自噬均增强,且老年DSS小鼠自噬增强程度较高。推测可能与老年DSS小鼠结肠组织炎症较重相关。3.自噬抑制剂3-MA处理老年DSS小鼠,出现结肠上皮细胞自噬活性受到抑制,结肠炎症状减轻。4.3-MA减轻炎症反应的可能机制为:3-MA可能通过降低趋化因子表达,减少巨噬细胞募集,并抑制其向M1型巨噬细胞极化,降低TNF-α、IL-6水平,并抑制NF-κB信号通路,进而减轻炎症反应。第二部分肠粘膜屏障和肠道菌群在老年和青年炎症性肠病中的变化及可能机制研究目的:通过临床标本和动物模型两方面,从肠粘膜屏障功能、肠道菌群角度,探究老年和青年炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)发病机制的异同及衰老加重实验性小鼠结肠炎的可能机制。方法:1.收集老年和青年健康人、老年和青年溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者的肠粘膜组织(共4组,每组10例)。2.雄性C57BL/6小鼠青年(6-8周)和老年(56周),各分为对照组和实验组(共4组,每组6-10只),实验组予葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)饮用水、对照组予自由饮用水7天,第8天处死。3.收集老年和青年实验组DSS处理前粪便标本、处死后粪便及粘膜标本。电镜观察肠上皮细胞的结构;应用蛋白电泳、免疫组化染色法检测人和小鼠结肠组织粘附连接蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白occludin表达量;采用16s rDNA扩增子测序法进行菌群测定。结果:1.临床标本:电镜观察老年健康者肠上皮细胞间的紧密连接(tight junction,TJ)结构不连续,老年和青年UC肠上皮细胞间的TJ破坏明显。老年健康人结肠组织 E-cadherin(t=11.06,P<0.001)、occludin(t=1.519,P=0.203)表达量较青年健康人低,老年UC患者结肠组织E-cadherin(t=l.809,P=0.14)、occludin(t=2.393,P=0.07)表达量较青年UC患者低。2.动物实验2.1电镜观察老年对照组小鼠肠上皮细胞间TJ不连续,老年和青年DSS小鼠肠上皮细胞间的TJ模糊,破坏明显。老年对照组小鼠结肠组织E-cadherin(t=4.614,P=0.004)、occludin(t=3.918,P=0.008)表达较青年对照组低,老年DSS小鼠结肠组织 E-cadherin(t=0.932,P=0.387)、occludin(t=0.775,P=0.468)表达较青年DSS小鼠低。2.2老年和青年小鼠在DSS处理前后粪便、粘膜菌群均有显著差异;在DSS处理前,老年小鼠粪便菌群中有益菌(Lactobacillus)较青年小鼠减少,有害菌(Turicibacter,Parasutterella)增多;DSS处理后,老年小鼠肠道菌群中有益菌较青年小鼠减少(Odoribacter、Alistipes),有害菌增加(Turicibacter)。结论:与青年人比较,老年人肠粘膜屏障功能减退。衰老加重DSS诱导的小鼠结肠炎症状,其机制可能为年龄相关的肠上皮细胞的紧密连接、粘附连接损伤,使肠粘膜屏障功能减退;而年龄相关的肠道菌属改变,包括有害菌增加,有益菌减少,也可能加重结肠炎。