论文部分内容阅读
目的：通过大肠杆菌原核表达系统构建抗环胍氨酸肽四价小分子抗体（TeAb-anti-CCP-ScFv-P53），并进行可溶性表达及鉴定。 方法：（1）重叠PCR连接抗CCP-ScFv与HSA-P53基因片段，构建TeAb-anti-CCP-ScFv-P53目的片段。将目的片段分别转入以胞内表达为主的pET28a系统；以周质表达为主的pET22k、pAD22k系统；以胞内可溶表达为主的pETSumo、pETGST、pETNus、pMBPc系统；以培养基可溶表达为主的pMBPp系统。菌落PCR扩增，抽提基因组DNA测序鉴定。（2）将测序正确的阳性克隆转入BL21(DH3)感受态细胞，IPTG诱导可溶表达，SDS-PAGE凝胶及Western blot鉴定目标蛋白表达情况，选取有可溶表达的系统扩大培养、镍层析柱亲和纯化。（3）ELISA评价其特异性；非竞争ELISA法测定其亲和常数(Ka)；间接免疫荧光法鉴定其在体活性。 结果：（1）琼脂糖凝胶电泳证实目的片段构建成功；质粒DNA测序表明载体与目的片段连接正确。（2）SDS-PAGE凝胶及Western blot结果显示pETGST及pMBPp系统未见表达；pET28a、pET22K及pAD22K系统尚有蛋白表达，但主要在包涵体内，可溶性表达少，未能纯化出足量蛋白用于下一步试验；pSumo融合表达系统能够纯化到较高的纯度，但使用Sumo相应酶无法切除融合标签；pNus系统细胞裂解后形成高聚体，无法通过镍层析柱亲和层析得到富集；pMBPc系统获得了一定量的可溶表达，纯化成功。选取pMBPc系统进一步扩大培养。（3）可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53特异性与CCPII的结合，明显高于SSA、SSB、Sm、snRNP和RF；可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53亲和常数Ka≌3.61×108-4.28×109M-1；使用间接免疫荧光法以AKA、APF为底物证实其具有在体活性。 结论：（1）TeAb-anti-CCP-ScFv-P53可在pET28a、pET22K、pAD22K、pNus、pSumo及pMBPc系统中表达。在pET28a、pET22K、pAD22K中以包涵体表达为主，在pNus、pSumo及pMBPc呈现可溶性表达。（2）选择pMBPc系统为最终大量可溶性表达系统。（3）可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53有较高特异性及亲和力，并具有在体活性，为下一步在体实验奠定基础。