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第一部分胰腺癌干细胞的分离、培养和鉴定目的研究人胰腺癌细胞株PANC-1中肿瘤干细胞的分离、培养和鉴定方法。方法将PANC-1细胞进行培养,以CD44和CD24作为细胞表面标志。利用流式细胞仪,从该细胞株中分离出细胞亚群。通过裸鼠体内接种成瘤实验,鉴定各亚群细胞体内增殖能力;通过S-P法检测成瘤组织和PANC-1细胞株中CD44和CD24的表达,RT-PCR检测CD44和CD24 mRNA的表达。结果PANC-1细胞系在培养液I中培养时,CD44+和CD24+的表达分别为5.1%～17.5%和21.8%～70.1%,表型为CD44+CD24+的胰腺癌细胞仅占0.9%～3.5%,而在培养液II中培养,CD44+和CD24+的表达分别为5.9%～16.8%和19.5%～74.6%,CD44+CD24+为0.8%～4.1%。在两种培养基中,细胞各表型的表达无统计学意义。裸鼠皮下植入5×103个CD44+ CD24+亚群细胞,4周即可见明显的新生肿瘤块(2/8),而CD44-CD24-亚群,即使植入1×105个细胞,12周也难形成种植瘤。前者体外成瘤能力比后者至少强20～50倍(P<0.05或P<0.01);所形成的肿瘤和PANC-1细胞系无组织学差异。实时定量逆转录PCR结果显示,同一培养基内各组细胞均表达CD44和CD24mRNA,各组间CD44和CD24mRNA的表达值差异无统计学意义(P>0.05);但不同培养基中,CD44和CD24mRNA的表达值差异性显著(P<0.01)。结论CD44和CD24可作为分选PANC-1中肿瘤干细胞的表面标志;分选出的CD44+CD24+亚群细胞具有肿瘤干细胞的特征。第二部分胰腺癌干细胞的生物学特性目的初步了解胰腺癌干细胞生物学特性。方法采用MTT比色法检测细胞体外增殖活性,利用流式细胞仪分析细胞周期,TRAP银染法测定端粒酶活性。结果与CD44-CD24-亚群比较,CD44+CD24+亚群生长缓慢,第7天才出现指数生长的趋势,增殖能力较低,倍增时间更长,前者第5天已出现指数生长的趋势。与对应的亚群细胞相比,CD44+、CD24+和CD44+CD24+细胞,无论S期比例,还是(S+G2/M)期比例都较低(P<0.05或P<0.01)。具有干细胞特性的CD44+CD24+细胞端粒酶活性比对应组要高得多。结论胰腺癌干细胞具有体外增殖能力较低,倍增时间较长,端粒酶活性高,处于相对静止状态等特性。第三部分Notch1信号系统对胰腺癌干细胞增殖与分化的调控目的探讨激活的Notch1信号系统对胰腺癌干细胞增殖与分化的调控。方法向体外培养的胰腺癌干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂γ-secretase inhibitor II(MW167),空白对照加PBS缓冲液。RT-PCR、免疫印迹(Western blot)、流式细胞仪和免疫组化等方法检测Notch1信号系统的表达。结果胰腺癌干细胞中有Notch1和JAG1表达;使用MW167诱导时,细胞周期的S期和G1期所占的百分比降低,干细胞所表达的CD44和CD24亦显著降低(P<0.05或P<0.01);而使用rhNF-κB诱导,则S期和G1期所占的百分比显著增高,同时,CD44和CD24表达也增高(P<0.05或P<0.01)。结论当Notch信号系统被激活时,胰腺癌干细胞进行增殖;当Notch信号系统被抑制时,胰腺癌干细胞进行分化。