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阪崎肠杆菌是一种重要的食源性致病菌,主要通过婴幼儿配方奶粉的摄入而引起新生婴儿脑膜炎、致死性小肠结肠炎和菌血症。因此,建立快速、灵敏、特异的检测方法和操作方便、重复性高的分型溯源技术,有利于食品中阪崎肠杆菌的快速鉴定,对预防和控制阪崎肠杆菌感染疾病的流行具有重要意义。
阪崎肠杆菌的生化检测技术存在耗时、操作繁琐、假阳性或假阴性结果突出等缺陷,本研究以阪崎肠杆菌为研究对象,依据外膜蛋白A和α-葡萄糖苷酶基因建立起阪崎肠杆菌的双重PCR方法,并且开展特异性验证和灵敏度测定等研究以及实际样品的检测,结果表明该方法具有特异性强,模拟样品灵敏度达104CFU/ml等优点,并且灵敏度不受样品中杂菌存在带来的干扰,可以应用于实际样品中阪崎肠杆菌的快速检测与鉴定。
目前,国际上无公认的阪崎肠杆菌标准分型技术,这给阪崎肠杆菌的溯源工作带来很大困难,本研究首次优化阪崎肠杆菌ERIC-PCR扩增指纹图谱的条件和参数,开展了阪崎肠杆菌(ATCC51329)ERIC-PCR指纹图谱主带的认定、克隆、测序等研究,研究发现该序列具有阪崎肠杆菌种特异性,基于该序列建立起分子检测方法及该菌的系统进化分析,结果表明新建的分子方法特异性强、灵敏度高;系统进化树显示阪崎肠杆菌具有不同的进化分支,并且标准菌株ATCC51329单独形成一个分支,与标准菌株ATCCBAA-894的差异性超过5%以上,支持了Iversen等对阪崎肠杆菌需重新分类的建议。在前期研究的基础上,开展奶粉中阪崎肠杆菌的调查研究,分离到阪崎肠杆菌野生菌株22株,进行阪崎肠杆菌的表型分型如API-20e生化图谱、抗生素抗性图谱与分子分型研究如RAPD-PCR,ERIC-PCR等,结果显示22株菌株具有三种不同的API-20e生化型和6种抗性图谱分型,3个ERIC-PCR分型簇和6个RAPD-PCR分型簇,不同分型结果比较表明ERIC-PCR分型技术与表型分型之间具有很好的相关性,而且ERIC-PCR技术操作简单、重复性较好,在阪崎肠杆菌的分型溯源研究方面具有很大的应用前景。
针对Iversen等研究表明阪崎肠杆菌需要重新分类的建议,创新性地开展基于α-葡萄糖苷酶基因对阪崎肠杆菌检测及系统进化研究工作。结果表明PCR方法灵敏度较好,特异性强。根据α-1,4-葡萄糖苷酶基因的测序结果表明,簇A包含有16株菌,并且之间的差异在0.02%到1.85%之间。其他6株菌在簇B中,与标准菌株ATCC29544的差异在0.32%。而在α-1,6-葡萄糖苷酶序列比较的基础上,12株菌分布在簇A,彼此之间有0.0%到1.9%的差异。而簇B中的7株菌与标准菌株ATCC29544的差异性在0.0%到0.25%之间。奇怪的是基于两种基因的分析,阪崎肠杆菌ATCC51329单独形成一个分支与ATCC29544的差异大于>5%,这或许表明在阪崎肠杆菌进化过程中的具有一个特殊的进化分支或者目前的阪崎肠杆菌包含有相近遗传特征的新种。
大肠杆菌、沙门氏菌以及阪崎肠杆菌的污染调查结果表明:沙门氏菌全部来源于肉制品,阳性率达11.67%,而乳制品、奶制品以及水产品中均未分离到沙门氏菌;大肠杆菌在水产品及肉制品中污染较为严重,阳性率分别为12%和17%,而其他类型食品中大肠杆菌零星存在。在分离菌株的基础上,构建了食源性致病菌ERIC-PCR指纹图谱,为预防和控制食源性疾病提供重要的参考数据。