诸多调查研究发现,在相同的温度条件下,饲料原料中水分含量都处于安全水分以下时,不同饲料原料中黄曲霉毒素（Aflatoxin,AF）的污染程度依然各不相同,例如,玉米和花生粕相比于小麦和豆粕更容易被AF污染。了解不同饲料原料中AF污染差异形成的原因,可以为饲料生产中AF污染的防治提供一定的科学依据。因此本研究根据不同饲料原料营养成分组成的差异,研究不同营养成分对黄曲霉生长和产毒的影响及其作用机制,从而阐明不同饲料原料中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB₁）污染差异性的原因。主要研究内容如下:1.油脂对黄曲霉生长和产生AFB₁的影响及其可能的作用机制本试验选择饲料原料:小麦、玉米、大豆、花生、大豆粕、花生粕、玉米胚乳和玉米胚作为试验材料。在未脱脂和脱脂的饲料样品中分别接种黄曲霉孢子液,并且在脱脂饲料样品中添加10%的不同油脂（玉米油、大豆油、花生油和小麦胚芽油）后接种黄曲霉孢子液,于30℃培养15 d。研究不同饲料样品中AFB₁的积累情况以及不同油脂在不同脱脂饲料样品中对黄曲霉产生AFB₁的影响。其次,在人工合成培养基中添加0.5%-8.0%的玉米油、大豆油、花生油和小麦胚芽油,进一步研究不同油脂对黄曲霉生长和合成AFB₁的影响,并测定AFB₁合成中关键基因及蛋白的表达量。1)不同原料中AFB₁的积累情况及不同油脂在脱脂原料样品中对黄曲霉合成AFB₁的影响。粗脂肪含量高的原料如大豆、玉米胚和花生中AFB₁的含量较高,且脱脂样品中AFB₁的含量要明显低于未脱脂的样品,但是在脱脂样品中添加10%的玉米油能恢复脱脂样品对AFB₁合成的促进作用。在不同脱脂样品中分别添加10%的玉米油、花生油、大豆油、小麦胚芽油发现,花生油对黄曲霉产AFB₁的促进作用最强,小麦胚芽油的作用相对较弱。但是在不同脱脂样品中添加同一种油脂,原料中AFB₁的含量各不相同。以上结果说明,油脂含量可能是造成不同原料AFB₁污染差异的主要原因之一,且油脂种类对黄曲霉产毒也有一定的影响;此外,除了油脂,原料基质中其它成分也对黄曲霉产毒有较大影响。2)四种油脂在培养基中对黄曲霉生长及产毒的影响。结果显示,AFB₁的产量随着油脂添加量的增加而增加,当油脂的添加量≥1.0%时,花生油的促进作用最明显（P<0.05）,其次,玉米油>大豆油>小麦胚芽油。油脂均能促进黄曲霉菌落生长,黄曲霉菌落直径随着油脂添加量的增加也明显增加（P<0.05）,其中花生油的促进作用最强。4种油脂对黄曲霉产孢有一定的抑制作用,其中小麦胚芽油和大豆油的抑制作用最强。花生油对黄曲霉孢子萌发的促进作用最明显（P<0.05）,但大豆油的影响相对较小（P≥0.05）。说明油脂对黄曲霉产毒和黄曲霉菌落生长的作用一致,但对黄曲霉产毒与产孢的结果不一致。3)四种油脂对AF合成过程中关键基因及蛋白表达的影响。本试验检测了与AF合成相关的14个关键基因。结果表明,4种油脂均能明显促进基因afl R和afl S表达,其中花生油的作用最显著,其次是小麦胚芽油>玉米油>大豆油。同时,4种油脂均显著上调AF合成通路前段基因afl C和afl D（P<0.05）的表达。AF合成后段的基因afl O、afl Q和调节基因afl U在玉米油组和花生油组中明显上调（P<0.05）,而在其它两组中无显著差异。本试验应用i TRAQ技术研究发现,花生油、玉米油、大豆油和小麦胚芽油与对照组相比,差异蛋白分别有298个、236个、231个和168个;其中上调蛋白分别有179个、88个、123个和86个;下调蛋白分别有119个、148个、108个和82个。花生油对AF合成相关蛋白表达的影响最大,共有7个差异蛋白,其中蛋白Afl G、Afl K、Afl L、Afl O、Afl P和Afl V显著上调（P<0.05）,蛋白Afl B显著下调（P<0.05）。大豆油的影响相对较小,有3个上调蛋白Afl G、Afl O和Afl P。蛋白Afl G、Afl O和Afl P在4种油脂中均显著上调。说明,油脂可能是通过上调AF合成相关的关键基因与蛋白的表达从而促进黄曲霉合成AFB₁。2.不饱和脂肪酸对黄曲霉生长及合成AFB₁的影响在培养基中分别添加0.005%-6.0%的单一不饱和脂肪酸:油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸;以及按照油酸、亚油酸和亚麻酸在4种天然油脂中的比例配制成的4种混合脂肪酸（添加量:0.5%、2.0%和8.0%）,然后接种黄曲霉孢子液,于30℃培养7 d。研究单一不饱和脂肪酸和脂肪酸配比对黄曲霉生长及合成AFB₁的影响。1)不饱和脂肪酸在培养基中对黄曲霉生长和产AFB₁的影响。AFB₁的产量随着油酸、亚油酸和花生四烯酸添加量的增加而增加,但是亚麻酸明显抑制了黄曲霉合成AFB₁。4种脂肪酸均可促进黄曲霉菌落生长,其中亚麻酸的促进作用最明显。亚麻酸的添加量仅在0.5%以下时对黄曲霉产孢有一定的促进作用,其它3种脂肪酸影响较小。亚油酸和亚麻酸对黄曲霉孢子萌发有明显的促进作用（P<0.05）,0.05%和0.2%的油酸可以促进黄曲霉孢子萌发,但当油酸的添加量进一步增加,明显抑制了黄曲霉孢子萌发（P<0.05）,花生四烯酸明显抑制了黄曲霉孢子萌发（P<0.05）。2)混合脂肪酸对黄曲霉生长及产生AFB₁的影响。按照花生油和玉米油配比的混合脂肪酸在添加量为0.5%和2.0%时,能促进AFB₁合成;按大豆油配比的2.0%和8.0%混合脂肪酸能抑制黄曲霉产AFB₁;按小麦胚芽油配制的混合脂肪酸明显抑制了AFB₁合成。按小麦胚芽油配比的脂肪酸明显促进了黄曲霉菌落生长,而按花生油配比的脂肪酸对黄曲霉菌落生长无明显影响。当添加量达到8.0%时,4种配比混合脂肪酸显著抑制了黄曲霉孢子的产生（P<0.05）。以上结果说明,油脂中不饱和脂肪酸的种类和含量可能是造成不同油脂对黄曲霉产毒及生长影响不同的主要因素。3.饲料原料基质中不同成分对黄曲霉生长及合成AFB₁的影响及其可能的作用机制在液体培养基中分别添加淀粉（添加量为:0.5%-5.0%）、可溶性糖（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、棉子糖和水苏糖的添加量为:0.5%、1.0%、3.0%和6.0%）、氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸和甘氨酸的添加量为:0.5%、1.0%和2.0%）和微量元素（铜,5 mg/L-50 mg/L;铁,20 mg/L-200 mg/L;锌,20 mg/L-100 mg/L;锰,10 mg/L-100 mg/L）,接种黄曲霉孢子液,30℃培养3 d-5 d,研究它们对黄曲霉合成AFB₁、生长以及AFB₁合成中关键基因（afl R、afl S、afl D、afl M和afl P）表达量的影响。1)淀粉和可溶性糖的影响。淀粉作为唯一碳源时,不利于黄曲霉合成AFB₁。当可溶性糖的添加量从1.0%增加到3.0%后,AFB₁的合成量急剧增加（果糖除外）,麦芽糖和蔗糖的作用最明显,其次是葡萄糖和水苏糖,而果糖和棉子糖对AFB₁合成促进作用相对较弱。随着可溶性糖添加量增加,均能明显促进黄曲霉菌丝生长,其中水苏糖的作用最显著（P<0.05）。相比于1.0%的蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和水苏糖,3.0%的可溶性糖均能明显促进afl S、afl D、afl M和afl P基因表达,且葡萄糖（P<0.01）和水苏糖（P<0.001）也能促进了afl R基因的表达。说明饲料原料中可溶性糖含量越高,越容易被AFB₁污染。2)氨基酸的影响。当氨基酸的添加量为0.5%时,谷氨酸明显促进AFB₁合成,其次是天冬氨酸和精氨酸,丙氨酸和甘氨酸的作用相对较弱。随着天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸添加量的增加能显著促进黄曲霉菌丝生长（P<0.05）。天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸都可以不同程度地促进关键基因afl R、afl S、afl D、afl M和afl P的表达。说明饲料原料中谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸的含量对黄曲霉的产毒和生长有很大的影响。3)微量元素的影响。4种微量元素中铜、铁和锰对黄曲霉合成AFB₁有明显的抑制作用（P<0.05）,但锌能显著促进AFB₁合成（P<0.05）。在4种微量元素中,铜明显抑制了黄曲霉菌丝生长（P<0.05）,而锌、铁和锰均能促进黄曲霉菌丝生长。当培养3 d时,锌能够显著地促进基因afl R、afl S、afl D、afl M和afl P的表达（P<0.001）;在培养5 d时,铜明显抑制了这5个关键基因的表达。说明,饲料原料中锌的含量越高,越有利于黄曲霉产毒。综上所述,本研究得出以下结论:1)原料中油脂是影响黄曲霉产生AFB₁的重要因素,其中花生油对黄曲霉合成AFB₁和生长的影响最大。2)油脂中不饱和脂肪酸的种类及含量,可能是不同油脂对黄曲霉产毒和生长的影响存在差异的主要原因。3)天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、水苏糖和锌能够明显地刺激AFB₁产生,而淀粉、铜、铁和锰不利于黄曲霉产生AFB₁。4)不同饲料原料中AFB₁污染存在的差异是由各种成分共同作用的结果。油脂、可溶性糖、氨基酸、微量元素可能是通过对黄曲霉的生长以及AF合成过程中关键基因和蛋白不同程度的调节,来影响黄曲霉在饲料原料中产生AFB₁。