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第一部分 基于TPX2和MMP12的预测模型与非小细胞肺癌预后关系的研究目的:利用公共数据库内非小细胞肺癌相关基因表达谱芯片数据,筛查在非小细胞肺癌中异常表达的相关基因簇,并对非小细胞肺癌组织进行验证,建立非小细胞肺癌患者预后预测模型。方法:(1)对公共数据库中非小细胞肺癌相关基因进行检索和筛选,选取符合实验要求的表达谱芯片数据。(2)采用生物信息分析工具与方法,分析基因表达谱,从中筛选在非小细胞肺癌中异常表达的相关基因簇。(3)采用qRT-PCR和IHC方法对候选基因进行表达验证。(4)采用Cox回归分析方法分析显著预后相关指标。(5)在152例病例中,应用logistic回归方法建立预后预测模型。(6)对所有病例进行临床随访,采用Kaplan—Meier存活曲线分析该分子分型模型在评估非小细胞肺癌患者预后中的价值。(7)采用ROC曲线及曲线下面积(AUC)比较该预后模型与TNM分期对预后评估的价值。结果:(1)公共数据库中检索到符合实验目的2组非小细胞肺癌基因表达谱数据:GSE18842和GSE31552。(2)对两组肿瘤与正常差异表达分析结果发现:GSE18842芯片数据集中发现了 1856个变化显著的基因。GSE31552芯片数据集中发现334个变化显著的基因。比较发现,在两组数据集中共同表达上调基因143个,共同表达下调基因126个。(3)QRT-PCR检测方法结果表明与癌旁正常组织相比,TPX2和MMP12的mRNA表达水平在非小细胞肺癌组织中显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05),DSG3、SFTPC、TMEM100和AGER的mRNA表达水平在肿瘤组织和癌旁正常组织中无显著差异(P>0.05)。免疫组化结果提示TPX2蛋白在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率为48.7%(74/152);MMP12蛋白的阳性表达率为58.6%(89/152)。(4)多元Cox回归分析表明有无术后辅助治疗与术后无病生存时间无显著相关(P=0.059),而TNM分期、肿瘤分级、TPX2蛋白表达和MMP12蛋白表达与术后无病生存时间显著相关(P<0.05)。多元Cox回归分析表明有无术后辅助治疗与术后总体生存时间无显著相关(P=0.062),而TNM分期、肿瘤分级、TPX2蛋白表达和MMP12蛋白表达与术后总体生存时间显著相关(P＜0.05)。(5)无病生存预测模型如下:Y=3.234*TNM+2.928*Grade+0.026*TPX2+0.025*MMP12。术后总体生存预测模型如下:Y=3.223*TNM+3.114*Grade+0.030*TPX2+0.025*MMP12。(6)生存分析结果显示,低危组患者术后无病生存率高于高危组患者。低危组和高危组患者术后五年无病生存率分别为26.2%和17.6%,差异具有统计学意义(P=0.025);低危组和高危组患者术后五年总体生存率分别为37.7%和21.9%,差异具有统计学意义(P=0.021)。(7)无病生存模型的ROC曲线下面积(AUC)高于TNM分期(0.771(95%CI,0.689-0.853)vs 0.719(95%CI,0.633-0.804));总体生存模型的ROC曲线下面积(AUC)高于TNM分期(0.761(95%CI,0.678-0.844)vs 0.700(95%CI,0.612-0.787))。结论:(1)建立了一个包含TPX2和MMP12基因表达和传统临床病理分期的预测非小细胞肺癌患者术后预后的模型。(2)该模型可以准确地将非小细胞肺癌患者分为两大类,预测患者术后预后。第二部分 TPX2对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响及其机制研究目的:研究通过RNA干扰抑制TPX2基因后非小细胞肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响及其机制。方法:(1)采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测非小细胞肺癌H157、H1299、H1650及A549细胞中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平。(2)采用实时荧光定量PCR和Westernblotting方法对转染siRNA前后的非小细胞肺癌A549、H1299细胞株进行鉴定。(3)采用CCK-8增殖实验检测TPX2表达下调对非小细胞肺癌A549、H1299细胞增殖的影响。(4)通过Tanswell小室迁移实验检测TPX2表达下调对非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞胞迁移和侵袭的影响。(5)采用Westernblotting技术检测转染前后非小细胞肺癌A549、H1299细胞中PI3K-AKT信号通路关键分子(PI3K、AKT和p-AKT)及MMP9和MMP12蛋白表达的变化。(6)采用激动剂IGF-1实验阐明TPX2调控PI3K/AKT信号通路活性及其下游MMP9和MMP12的表达影响。结果:(1)与人支气管上皮细胞HBE相比,非小细胞肺癌H157、H1299、H1650及A549细胞中呈现TPX2 mRNA和蛋白的高表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)TPX2 siRNA组中TPX2 mRNA和蛋白的相对表达水平显著低于对照siRNA组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)TPX2下调的非小细胞肺癌A549、H1299细胞速度明显慢于对照siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)TPX2表达下调显著降低非小细胞肺癌A549、H1299细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。(5)TPX2表达下调能显著降低非小细胞肺癌A549、H1299细胞中PI3K、p-AKT、MMP9和MMP12蛋白的表达。(6)激动剂IGF-1能完全削弱TPX2-siRNA抑制A549、H1299细胞中PI3K/AKT信号通路活性及其下游MMP9和MMP12的表达。结论:敲除TPX2表达可抑制非小细胞肺癌A549和H1299细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时,TPX2调控PI3K/AKT信号通路活性及其下游MMP9和MMP12的表达机制是TPX2促进非小细胞肺癌细胞侵袭转移的重要机制。