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MYC2是植物中响应茉莉酸(Jasmonate,JA)信号通路的一个核心转录因子,在植物的次生代谢产物合成以及生长发育过程中发挥着重要的作用。关于JA参与植物次生代谢产物合成的研究已有较多报道,已知MYC2以不同的方式调控植物中的次生代谢产物。比如,它可以正调控黄酮类化合物的合成(如,花青素),但在拟南芥响应JA的色氨酸衍生物吲哚芥子油苷的合成中发挥抑制作用;在烟草中,NtMYC2a和NtMYC2b调控由JA诱导的尼古丁合成过程中的多步反应;苹果的MYC2通过调节JA信号通路中的正调控因子的表达来调控黄酮类化合物的生物合成。JA会抑制拟南芥中根的生长,MYC2作为JA信号通路中的核心因子,正向调节茉莉酸甲酯,使根的生长受到抑制。丹参(Salviamiltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生草本植物,其根及根茎作为一种著名的中国传统药材,已有2000多年的应用历史,目前主要用于治疗冠状动脉和心脑血管疾病。丹参的有效活性成分可以分为亲脂性的二萜醌类,比如我们熟知的丹参酮,以及亲水性的酚酸类化合物,主要包括迷迭香酸(RA)以及它的衍生物丹酚酸B(SalB)。本研究对过表达SmMYC2的转基因丹参进行了主要活性成分含量与转录组比较分析,进一步利用酵母单杂交研究SmMYC2直接调控的SalB合成途径上的靶基因,并观察过表达SmMYC2的转基因丹参根的形态以及测定其生物量,以期探究SmMYC2对丹参中酚酸类物质合成以及根生物量的影响。主要研究内容与结果如下:1.从实验室前期获得的过表达SmMYC2的转基因丹参中筛选表达量较高的株系。实时荧光定量PCR结果显示:过表达SmMYC2的转基因3号、8号、12号和14号株系(OEM-3、OEM-8、OEM-12和OEM-14)中SmMYC2的表达量分别是空载转化丹参株系(CK)中的2.7倍、3.7倍、8.4倍和3.1倍,因此我们选择SmMYC2表达量更高的OEM-8和OEM-12株系用于后续的实验。2.利用HPLC法检测了 OEM-8、OEM-12以及CK中酚酸类物质和丹参酮物质的含量,结果表明,过表达SmMYC2会提高酚酸类物质的生物合成量。在两月龄转基因丹参组培苗的根中,主要的有效成分是迷迭香酸以及其衍生物丹酚酸B,与CK相比,OEM-12株系中迷迭香酸的含量为CK的2.46倍,丹酚酸B的含量为CK的1.88倍。OEM-8株系中迷迭香酸含量为CK的2.40倍,丹酚酸B的含量为CK的1.51倍。然而,转基因株系和CK中都没有检测到丹参酮ⅡA以及隐丹参酮的累积。3.对OEM-12和CK进行了转录组测序分析。通过Illumina深度测序分别从OEM-12和CK两个cDNA文库获得了 3126万和2593万个读取,平均长度为296bp。利用Bowtie和RSEM软件分析了 OEM-12中功能基因的表达情况,鉴定出2964个差异表达基因(DEGs),其中1540个DEGs表达量上调,剩余的1154个DEGs表达量下调。通过KEGG分析,鉴定出20条DEGs富集的代谢通路,包括酚酸类物质、苯丙氨酸、酪氨酸和茉莉酸的生物合成代谢通路。为了验证转录组数据结果的准确性,对12个基因进行了实时荧光定量PCR,这些基因包括参与酚酸类合成通路的TAT1、CYP98A14、HPPR1、C4H1和RAS1,参与JA信号通路的JAZ1和JAZ3,参与丹参酮合成通路的DXS3、GGPPS1和HMGR4,以及参与类黄酮合成通路的FLS和F3’5’H。定量结果显示,这些基因的表达趋势与转录组数据结果一致,说明转录组结果可信。4.已知MYC2与基因启动子区的G-box结合调控基因的表达。我们分析了酚酸类物质合成通路上28个酶基因的启动子序列,发现SmTAT1、SmHPPR1、SmCYP98A14和SmRAS2等多个基因的启动子含有G-box序列,推测丹参SmMYC2可能直接与这些基因的启动子结合来调控它们的表达。基于转录组结果和荧光定量PCR分析结果,将SmPAL1、SmTAT1和SmCYP98A14启动子区构建到pHIS2载体上,将SmMYC2构建到pGADT7-AD载体上,利用酵母单杂交技术检测SmMYC2与SmPAL1、SmTAT1和SmCYP98A14的启动子区是否互作,结果显示,SmPAL1、SmTAT1和SmCYP98A14启动子区都与SmMYC2互作。5.对两月龄的过表达SmMYC2的转基因株系以及CK的根表型进行了观察分析,发现OEM-12株系的根与CK的相比生长受到了抑制,然后又测定了根的生物量,CK的生物量显著高于OEM-12株系根的生物量,每株CK的平均生物量为146.36±30.06mg,而每株OEM-12株系的平均生物量为88.07±8.93mg。本研究通过SmMYC2过表达转基因丹参株系中酚酸类物质的含量测定,转录组分析以及酵母单杂交实验,初步探究了SmMYC2调控丹参酚酸类物质合成的分子机制,为更深入地了解丹参SmMYC2调控丹参次生代谢产物合成的分子机制奠定了基础。