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本研究对可溶修饰型绿色荧光蛋白smGFP进行原核表达、纯化并制备其多克隆抗体。
通过体外DNA重组技术，将来源于pCAMBIA1301-smGFP质粒上的目的基因smGFP片段在T<,4> DNA连接酶的作用下，插入到原核表达载体pET-28a(+)的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点之间，构建重组质粒pET-28a(+)-smGFP。经过PCR扩增鉴定、酶切鉴定以及DNA序列分析，插入的目的基因smGFP的序列完全正确。将重组质粒pET-28a(+)-smGFP转化到大肠杆菌BL21(DE3)，加入终浓度为1.0 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)进行诱导，诱导后表达出肉眼可见的分子量大约为30 kDa的smGFlP融合蛋白，该smGFP融合蛋白以可溶形式存在，扩大培养浓缩后在变性条件下经Ni离子亲和层析得到纯品smGFP融合蛋白。用Bradford法测定该融合蛋白含量约为700 μg/ml。用纯化的smGFP融合蛋白免疫三只6-8周龄的BALB/c小鼠(15 μg/只，次)三次后，进行ELISA检测，获得的smGFP融合蛋白的多克隆抗体以1∶32000的比例稀释后仍可检测到0.025 μg左右的抗原(融合蛋白smGFP)。用制备的多克隆抗体Western-blot检测smGFP融合蛋白，AEC化学显色后，在硝酸纤维素膜上显示出明显的单一的特异性目的带。以上结果表明通过原核表达系统在大肠杆菌中表达出了smGFP融合蛋白，并得到大量纯化的smGFP融合蛋白及其多克隆抗体。可溶修饰型绿色荧光蛋白smGFP的多克隆抗体，为以绿色荧光蛋白作为报告基因的生物学研究提供了一种辅助检测方法，另外为GFP的体外应用及定量检测的发展奠定了基础。