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涝害是世界上许多国家的重大灾害,每年造成重大的经济损失.了解作物对水涝胁迫响应的分子机理,从而通过转基因手段提高作物的耐涝性,对于中国的农业生产具有重要的理论和现实意义.该研究的目的是分离鉴定与与耐涝相关的基因,同时用转基因方法证明分离的基因在抵抗淹水胁迫中的作用,为通过基因工程技术提高玉米耐涝性奠定基础.首先以淹水处理的玉米幼苗(submergence-treated maize seedling,SMS)根部为目标群体,未处理的玉米幼苗(untreated maize seedling, UMS)根部为对照群体,进行抑制差减杂交.用经过UMS差减的SMS cDNA构建了一个含有大约2000个独立克隆的差减文库.对随机挑取的1846个克隆进行杂交验证,获得了928个在SMS中特异表达或表达增强的候选克隆.对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段.Genebank中BLAST查询结果表明:6个克隆为已知的玉米核酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60％-90％;21个克隆在Genebank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因,或者由于序列位于变异丰富的3端而无法查到与其他物种基因的同源性.在95个独立克隆中,我们选择了一个与玉米血红蛋白基因有一定同源性(87％)的EST进行进一步的研究.首先用RACE方法扩增出其全长cDNA (728bp),Southern杂交分析表明此基因以单拷贝形式存在于玉米基因组中.Northern杂交分析表明此基因受淹水诱导表达,且在不同的淹水时间表达量不同.为了进一步研究其功能,构建了三个不同的植物表达载体(正义,反义和RNAi)并将其转入烟草.对转基因烟草的耐涝性检测表明,转正义玉米血红蛋白基因的烟草耐涝性明显增强,而转有反义和RNAi载体的烟草耐劳性几乎丧失.这些结果表明,玉米血红蛋白基因在玉米淹水耐性方面起着重要作用.另外,为了制备抗体进一步用Western blot检测转基因烟草血红蛋白的表达水平,将ZMHb在大肠杆菌里表达并纯化了目标蛋白.以SSH结合差异筛选克隆到的玉米淹水诱导表达EST序列ESI397为基础,设计3端引物,利用RACE克隆策略,获得一个长度为1.5kb的新基因.Northern杂交分析表明,该基因具有淹水诱导表达特性.Southern杂交分析表明该基因可能在玉米基因组中以单拷贝存在.利用生物信息学分析发现,该序列含有完整的阅读框架,编码360个氨基酸,在5端起始密码子上游有终止密码子TGA,3端非编码区有加尾信号AATAA和poly(A)尾.该新序列在非冗余核苷酸序列数据库中比较,无同源的已知基因存在,可能是一个淹水诱导表达的新基因.