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研究背景及目的自然杀伤(Natural killer, NK)细胞是机体主要的效应淋巴细胞,可清除体内的肿瘤细胞并抵御病毒、细菌等的入侵,发挥天然免疫监视功能。肿瘤患者体内NK细胞数量及活性降低与肿瘤的发生发展密切相关,是肿瘤免疫逃逸的关键因素。通过激活内源性NK细胞或将体外活化的NK细胞进行过继性转移,有望增强癌症患者机体免疫能力,对改善临床预后和提高存活率具有重要意义。NK细胞活性受大量细胞因子的调节。白细胞介素-18(Interleukin-18, IL-18)是一种多功能细胞因子,强烈诱导NK细胞分泌IFN-y并促进NK细胞的活化,从而影响NK细胞的抗肿瘤效应。当IL-18联合其他细胞因子如IL-12或IL-15体外刺激NK细胞时,对NK细胞的增殖、细胞毒性以及INF-γ分泌能力呈现更为显著的增强效应。白细胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)曾被广泛应用于恶性肿瘤免疫治疗,然而大剂量IL-2使用所引起的严重并发症极大地限制了其在肿瘤免疫治疗中的应用价值。目前,国际上研究热点是将IL-2与其他细胞因子联合应用,以降低IL-2的不良反应。临床研究发现,将重组人IL-18应用于进展期癌症患者时,与其他细胞因子相比,IL-18具有极少的毒副作用,且其发挥生物学活性的安全剂量范围更广。IL-18与IL-2联合应用有望成为增强NK细胞抗肿瘤效应的有效策略,但目前IL-18联合IL-2对NK细胞的具体调节作用及其机制尚不明确。本实验旨在观察IL-18和IL-2联合诱导的人外周血NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性及其表面活化性受体NKG2D表达情况,探究IL-18和IL-2对NK细胞的协同诱导活化作用,并初步分析其调节机制,为肿瘤免疫治疗提供新的思路和理论依据。研究方法Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从肝素抗凝的人外周静脉全血中无菌分离出外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。不同浓度的重组人IL-18(0,100,200 ng/m1)和重组人IL-2(0,100,200 U/ml)体外联合诱导新鲜分离的人PBMCs 48 h,实验分为IL-18和IL-2联合处理组、IL-18单独处理组、IL-2单独处理组以及对照组(未经细胞因子处理)。三色荧光-流式细胞分析技术检测CD107a阳性NK细胞比率以评估NK细胞对人白血病细胞K562和人结肠癌细胞HT29的杀伤活性。同样方法检测活化性受体NKG2D在NK细胞表面的表达水平变化。结果1.IL-18和IL-2联合诱导新鲜分离的人PBMCs48 h后,CD107a阳性NK细胞比率显著升高,明显高于IL-18或IL-2单独处理组,差异有统计学意义(P<0.01),提示NK细胞对肿瘤细胞K562和HT29的杀伤活性显著增强。2.不同的细胞因子刺激后,各实验组CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞群的百分比无显著性差异(P>0.05),提示IL-18与IL-2联合应用对人NK细胞的增殖无明显促进作用。3.新鲜分离的人PBMCs经IL-18(200 ng/m1)和IL-2(100 U/m1)刺激48 h后,流式细胞术分析结果显示,与单一应用IL-18或IL-2相比,IL-18和IL-2联合处理组NK细胞表面NKG2D受体表达水平明显提高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.细胞因子刺激过的人PBMCs经抗NKG2D中和抗体处理1h以阻断NKG2D介导的信号转导后,IL-18联合IL-2对NK细胞杀伤活性的上调作用被大大削弱,提示IL-18和IL-2对NK细胞毒活性的协同诱导作用在一定程度上依赖于NKG2D受体途径。结论IL-18联合IL-2可显著增强人外周血NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,并促进其表面活化性受体NKG2D的表达；IL-18与IL-2对NK细胞毒活性的协同诱导作用在一定程度上是通过NKG2D受体途径实现的。我们的研究为肿瘤免疫治疗提供了新的思路和实验依据,IL-18和IL-2联合疗法有望成为肿瘤免疫治疗的一种新手段。